PCR鑒定麻類(lèi)纖維基因組DNA提取方法

保琦蓓，尤建武，錢(qián)　丹，任清慶，傅科杰

（1.寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局紡織品檢測(cè)中心，浙江寧波　315012 2.寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江寧波　315012）

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PCR鑒定麻類(lèi)纖維基因組DNA提取方法

保琦蓓1,2，尤建武1，錢(qián)丹1，任清慶1，傅科杰1,2

（1.寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局紡織品檢測(cè)中心，浙江寧波315012 2.寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江寧波315012）

摘要：以漢麻原麻韌皮纖維與漢麻纖維兩組特殊樣品為材料，比較了傳統(tǒng)的CTAB法、試劑盒粗提法及磁珠純化精提法DNA提取方法對(duì)提取此類(lèi)樣品的適宜性。結(jié)果表明，采用試劑盒粗提法可從漢麻原麻纖維中提取高品質(zhì)的可用于下一步PCR檢測(cè)的DNA樣本，而麻類(lèi)纖維的處理工藝對(duì)其DNA的影響很大，隨著麻類(lèi)纖維從原麻被加工為精干麻、紗線(xiàn)與織物的過(guò)程中，已很難提出高品質(zhì)DNA樣品，雖然存在一定量的DNA，但通過(guò)完整性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這類(lèi)DNA樣品已無(wú)法滿(mǎn)足下一步的PCR鑒定檢測(cè)的要求。

關(guān)鍵詞：麻類(lèi)纖維；基因組DNA；提取；PCR檢測(cè)

0　引言

在纖維檢測(cè)領(lǐng)域，DNA檢測(cè)技術(shù)在天然動(dòng)物纖維鑒別中已得到廣泛應(yīng)用，研究人員已完成了傳統(tǒng)的光學(xué)投影儀法。燃燒法與化學(xué)溶解法無(wú)法完成羊絨與羊毛纖維的鑒別，以及對(duì)羊毛、羊絨、駱駝毛與牦牛毛之間快速簡(jiǎn)便的纖維定性分析[1]。目前國(guó)外對(duì)羊毛羊絨纖維的分析已從定性分析發(fā)展到兩組分混紡纖維的定量分析，可用于有實(shí)驗(yàn)條件的紡織檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行相應(yīng)纖維成分的輔助檢測(cè)[2]，而國(guó)內(nèi)將DNA檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于天然植物纖維的鑒定方面的研究較少，且對(duì)麻類(lèi)植物的分子生物學(xué)研究主要集中在改良遺傳育種方面。國(guó)外采用分子生物學(xué)方法對(duì)麻類(lèi)纖維進(jìn)行鑒定的相關(guān)方面研究目前主要集中在公安刑偵與考古學(xué)中的纖維鑒定應(yīng)用方面。

研究和開(kāi)發(fā)麻類(lèi)纖維的DNA檢測(cè)技術(shù)，關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)在于DNA的提取。一般新鮮葉片提取的DNA品質(zhì)最高，可基本滿(mǎn)足各種測(cè)試需求。而麻類(lèi)植物韌皮纖維中含有大量的多糖、酚類(lèi)等次生代謝物質(zhì)，細(xì)胞壁厚破壁較難，尤其是多糖易與DNA結(jié)合形成極難溶解的黏稠狀物質(zhì)，并抑制PCR反應(yīng)過(guò)程中Taq DNA酶的活性，使擴(kuò)增的條帶模糊甚至消失，嚴(yán)重影響PCR的反應(yīng)效果[3]。大多數(shù)的試驗(yàn)都采用麻類(lèi)植物幼嫩葉片為材料進(jìn)行提取，但作為紡織材料的韌皮纖維作物，經(jīng)過(guò)收獲、剝制、干燥等過(guò)程得到原麻，再經(jīng)脫膠得到精干麻，得到的麻纖維可用于紡紗與織造。若對(duì)各種麻類(lèi)進(jìn)行DNA檢測(cè)，必須首先考慮對(duì)纖維中的DNA進(jìn)行提取。美國(guó)研究者M(jìn)ignon Dunbarden利用PCR片段中的堿基對(duì)序列分析或限制性?xún)?nèi)切酶分析成功鑒別了麻質(zhì)繩索中的漢麻、劍麻與亞麻纖維的成分，擴(kuò)增后的PCR片段可達(dá)到771堿基對(duì)長(zhǎng)度[4]。Terence M.Murphya等人利用DNA技術(shù)從以色列汲淪谷的猶太人墓穴中發(fā)現(xiàn)的麻類(lèi)織物中鑒定出其成分主要為亞麻，所有樣品中均存在少量或微量的漢麻DNA分子，此研究?jī)H利用短片段物種特異性PCR來(lái)進(jìn)行鑒定[5]。候思名等通過(guò)優(yōu)化后的CTAB法，在提取的過(guò)程中通過(guò)抗氧化和去除多糖的方法成功提取了苧麻幼嫩葉片中的DNA[6]。而陳平等以常溫干燥保存一年和六年的陳年苧麻原麻為原材料，也采用改進(jìn)的CTAB法提取了苧麻原麻中的DNA，得到的DNA約為20 kb[3]。裴黎采用改良高鹽低pH方法方法成功提取了陳舊漢麻干葉標(biāo)本及漢麻樹(shù)脂中的基因組DNA，并成功提取了一份22年陳舊漢麻樹(shù)脂的基因組DNA，使其可以用于法庭科學(xué)中陳舊漢麻基因組DNA的提取[7]。

作為紡織材料的韌皮纖維作物，麻纖維也會(huì)根據(jù)生產(chǎn)的需要可能會(huì)存放相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間，再經(jīng)過(guò)收獲、剝制、干燥等過(guò)程得到原麻，原麻經(jīng)脫膠后得到精干麻，再用于紡紗與織造。要對(duì)各種麻類(lèi)進(jìn)行DNA檢測(cè)，首要問(wèn)題也是纖維中的DNA提取。本研究中選取了兩組特殊樣品進(jìn)行麻類(lèi)纖維基因組提取方法的優(yōu)化，希望找到適合麻纖維DNA提取的方法。

1　試驗(yàn)

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)采用的樣品類(lèi)型分為兩組，第一組為不同存放時(shí)間的漢麻原麻韌皮纖維，第二組為根據(jù)漢麻纖維的生產(chǎn)工藝流程處于各個(gè)生產(chǎn)階段的纖維產(chǎn)品。同時(shí)選擇棉花樣品作為對(duì)照，選擇一種存放期約為1年的苧麻纖維來(lái)驗(yàn)證優(yōu)化后的提取方法。樣品具體信息見(jiàn)表1。

1.2提取試驗(yàn)方法

采用傳統(tǒng)的CTAB法與試劑盒法提取法兩種方法進(jìn)行提取方法的優(yōu)化，其中試劑盒提取法又分別考察了粗提方法與后續(xù)的磁珠純化精提方法對(duì)提取DNA質(zhì)量的影響。試驗(yàn)開(kāi)始前均先取一定量的樣本于離心管中，加入無(wú)菌水在4℃下浸泡2 h。

表1　樣品信息表

（1）CTAB法

分別選取樣品1～8號(hào)約1.0 g，在研缽中加入液氮預(yù)冷，將葉片放入液氮中研磨均勻，直至全部研磨至粉末，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，加入600 μL 65℃預(yù)熱的CTAB溶液（用前加入2%的巰基乙醇）。將裝有CTAB和樣品的EP管置入65℃水浴，約1 h。冷卻后，加入600 μL的酚：氯仿：異戊醇(25:24∶1= 300∶288∶12)，混勻，12 000 rpm，離心15 min。吸取上清液，置入空EP管，加入600 μL氯仿：異戊醇（24∶1=576∶24），12 000 rpm。離心15 min，吸取上清液轉(zhuǎn)入空離心管中，加入1/3體積NaAc（3moL/L），加入1 mL-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻后置于-20℃下3～4 h，然后于12 000 rpm離心10 min，棄去上清液，向離心管中加入75%的乙醇洗滌2～3次，置于吸水紙上倒置晾干。使用時(shí)加入ddH2O（10～20 μL）溶解備用。

（2）試劑盒提取方法

a.組織破碎：浸泡后的樣本在加液氮的條件下在研缽中搗成粉末，并將粉末裝入2 mL離心管中（研磨時(shí)應(yīng)間隔加入液氮以防止組織融化）。加入1 mL Plant DNA zol（貨號(hào)116901）試劑盒試劑，將離心管置入65℃水浴15 min。

b.DNA沉淀：加1mL氯仿，混合均勻。12000rpm,離心5 min。小心取上清（DNA在上層,試驗(yàn)要求為純DNA），移入空的1.5 mL離心管中，加0.7體積的異丙醇，4℃下12 000rpm離心10 min，棄上清，12 000 rpm,離心5 min，棄上清。

c.DNA清洗：加入1 mL 75%乙醇至離心管中，顛倒數(shù)次以重懸DNA，直立離心管1 min至DNA團(tuán)塊沉至管底，傾去或吸除洗滌液。細(xì)小的DNA沉淀團(tuán)塊易在傾倒洗滌液時(shí)丟失，可室溫3 000 xg離心3～5 min，然后傾去或吸除洗滌液，重復(fù)清洗1次，最后簡(jiǎn)短離心，用槍頭小心吸棄殘留液體。

d.DNA溶解：室溫靜置約10 min，使殘余乙醇揮發(fā)，注意不要完全晾干DNA，加入適量（100 μL）滅菌雙蒸水或TE緩沖液，使DNA沉淀溶解。若DNA溶液中存在不可溶雜質(zhì)，可于4℃12 000rpm，離心10 min去除雜質(zhì)，并在4℃或-20℃保存DNA溶液（此處得到的為粗提物產(chǎn)物）。

e.DNA純化：取50 μL的粗提DNA轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中，充分渦旋振蕩AMPure XP beads（貨號(hào)A63882），加入90 μL充分懸浮好的AMPure XP beads于上述離心管中，吸打或渦旋振蕩混勻，室溫放置5 min，然后將上述離心管放置于磁力架上至少2 min，棄上清，保持1.5 mL的離心管在磁力架上，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇，室溫保持30 s，棄上清。重復(fù)上述2個(gè)步驟，室溫干燥10 min（磁珠出現(xiàn)裂痕即為干燥完全），加入52.5 μL的Re?suspension Buffer于上述離心管中，吸打或渦旋振蕩混勻，室溫保持2 min，離心管放置于磁力架上放置至少5 min，吸取50 μL的上清于空的1.5 mL離心管中，得到的產(chǎn)物為精提物產(chǎn)物。

1.3提取結(jié)果評(píng)價(jià)

各樣品DNA提取后，測(cè)定OD260與OD280值，計(jì)算DNA的產(chǎn)量，同時(shí)通過(guò)Qubit熒光計(jì)定量測(cè)定提取的DNA濃度，用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，通過(guò)上述參數(shù)選擇最優(yōu)的提取方法，最后選擇符合質(zhì)量要求的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，驗(yàn)證DNA的完整性。第1組引物組為漢麻的特征引物，其序列為上游引物5ˊ-ATC?GAAGAGCAGCAACAAGC-3ˊ，下游產(chǎn)物5ˊ-ATCGAAGAGCAGCAACAAGC-3ˊ；第2組引物組為苧麻的特征引物，其序列為上游引物5ˊ-TC?CAAGCATTTCCCGAACGA-3ˊ，下游產(chǎn)物5ˊ-GCCCGATCTTCCAGCTCTAC-3ˊ；第3組引物組為亞麻的特征引物，其序列為上游引物5ˊ-TCAT?CAACAGCGCATCTGGT-3ˊ，下游產(chǎn)物5ˊ-AGCCTTACAGCCACACACTC-3ˊ。對(duì)試劑盒方法的粗提法與精提法提取DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)DNA樣品的質(zhì)量進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)價(jià)。采用PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25 μL PCR反應(yīng)體系包括麻類(lèi)纖維樣品基因組DNA20 ng，2×Premix Taq緩沖液12.5 μL，5 μM上、下游引物各1 μL，Premix Taq DNA聚合酶(Code No.RR003Q)，余量為ddH2O。PCR的擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，27個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，10℃保存。

2　結(jié)果與討論

2.1不同提取方法下DNA產(chǎn)量、濃度與完整性

根據(jù)1.2的提取方法，對(duì)選取的樣品進(jìn)行的基因組DNA的提取，所測(cè)OD260/OD280值與濃度的數(shù)值結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，無(wú)論是OD260/OD280值指標(biāo)還是提取的濃度大小，試劑盒的提取方法優(yōu)于傳統(tǒng)的CTAB法，特別是在提取DNA的濃度上，試劑盒法對(duì)較為新鮮的纖維樣品的提取濃度高出CTAB法10倍。由于精提法是DNA初提之后的進(jìn)一步提純，因此提取的DNA濃度有所降低，但是DNA的質(zhì)量需要通過(guò)電泳方法進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。

表2　不同提取方法下DNA的OD260/OD280值與濃度

為了考察試劑盒粗提法與精提法兩種處理方法提取的DNA的完整性，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)提取效果提供依據(jù)，試驗(yàn)中采用1%瓊脂凝膠電泳對(duì)提取的DNA進(jìn)行檢測(cè)。將提取的DNA樣品在冰上融化后，充分混勻并離心，取適量樣品進(jìn)行檢測(cè)，采用1%濃度的瓊脂糖凝膠在5 V/cm下移動(dòng)30 min，得到的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　DNA樣品的1%瓊脂凝膠電泳圖

由圖1可以看出，試劑盒粗提法與精提法提取DNA樣品的完整性并無(wú)太大區(qū)別，在提取的DNA濃度的量可供下一步試驗(yàn)使用時(shí)，采用粗提方式提取的DNA樣品也能夠滿(mǎn)足下一步的檢測(cè)要求，可以節(jié)約大量的人力和物力。另外，從圖1中還可以看出，麻類(lèi)的原麻纖維樣品（樣品1～樣品4）隨著存放時(shí)間的增加DNA在發(fā)生降解，一般存放超過(guò)1年以上對(duì)提取DNA的質(zhì)量影響最大，但即使存放時(shí)間在2年以上也可采用本試驗(yàn)的方法提取出可用于PCR檢測(cè)的DNA樣品，但麻類(lèi)纖維的處理工藝對(duì)麻類(lèi)纖維（樣品5～樣品7）中DNA的影響很大，隨著麻類(lèi)纖維從原麻被依次加工為精干麻、紗線(xiàn)與織物的過(guò)程中，幾乎很難提取出高品質(zhì)DNA樣品，雖然其中存在一定量的DNA，但通過(guò)完整性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這類(lèi)DNA樣品已無(wú)法滿(mǎn)足下一步PCR鑒定檢測(cè)的要求。

2.2提取DNA的PCR鑒定檢測(cè)

采用第1組引物組漢麻特征引物對(duì)粗提物與精提物的擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2，條帶1～11為粗提物擴(kuò)增結(jié)果，條帶12～22為精提物擴(kuò)增結(jié)果。采用漢麻的特征是因?yàn)槎寄軐?duì)不同存放時(shí)間的漢麻原麻纖維（樣品1～樣品4）進(jìn)行特異擴(kuò)增，擴(kuò)增后條帶為100～200 bp。此組引物并不能對(duì)（樣品5～樣品9）樣品進(jìn)行特異性擴(kuò)增，可以用來(lái)鑒定漢麻纖維。

圖2　漢麻特征引物對(duì)粗提物與精提物擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

采用第2組引物組苧麻特征引物對(duì)粗提物與精提物的擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3，條帶23～33為粗提物擴(kuò)增結(jié)果。由圖3還可以看出，采用苧麻的特征條帶可以對(duì)存放時(shí)間約1年的苧麻纖維進(jìn)行擴(kuò)增，條帶為200～300bp，采用此組苧麻的特征引物均不能對(duì)不同存放時(shí)間的漢麻原麻纖維（樣品1～樣品4）與其他漢麻產(chǎn)品（樣品4～樣品7）進(jìn)行特異擴(kuò)增。

圖3　苧麻特征引物對(duì)粗提物與精提物擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

采用第3組引物組亞麻特征引物對(duì)粗提物與精提物的擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4，條帶45～55為粗提物擴(kuò)增結(jié)果，條帶56～66為精提物擴(kuò)增結(jié)果。由圖4還可以看出，采用亞麻的特征條帶對(duì)所有樣品均不能擴(kuò)增出亞麻的特征產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果相一致。

圖4　亞麻特征引物對(duì)粗提物與精提物擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

3　結(jié)論

通過(guò)對(duì)各組特殊麻類(lèi)纖維樣品的DNA提取方法進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)采用試劑盒提取方法比傳統(tǒng)CTAB法提取DNA的品質(zhì)高，且試劑盒粗提法與精提法提取DNA樣品的濃度和完整性并無(wú)太大區(qū)別。在提取DNA濃度的量可供下一步試驗(yàn)使用時(shí)，采用粗提方式提取的DNA樣品也能夠滿(mǎn)足下一步的檢測(cè)要求，可以節(jié)約大量的人力和物力。研究發(fā)現(xiàn)，麻類(lèi)的原麻纖維樣品隨著存放時(shí)間的增加DNA在發(fā)生降解，一般存放超過(guò)1年以上對(duì)提取DNA的質(zhì)量影響最大，但即使存放時(shí)間在2年以上也能采用本試驗(yàn)的方法提取出能用于PCR檢測(cè)的DNA樣品。然而麻類(lèi)纖維的處理工藝對(duì)麻類(lèi)纖維中DNA的影響很大，隨著麻類(lèi)纖維從原麻被依次加工成精干麻、紗線(xiàn)與織物的過(guò)程中，幾乎很難提出高品質(zhì)的DNA樣品。雖然存在一定量的DNA，但通過(guò)完整性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這類(lèi)DNA樣品已無(wú)法滿(mǎn)足下一步的PCR鑒定檢測(cè)的要求。

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《紡織檢測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)》雜志專(zhuān)家委員會(huì)會(huì)議順利召開(kāi)

2016年1月5日下午，《紡織檢測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)》雜志專(zhuān)家研討會(huì)在上海市紡織科學(xué)研究院順利舉行，來(lái)自于檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)領(lǐng)域的各位大咖級(jí)專(zhuān)家委員會(huì)成員悉數(shù)到場(chǎng)，編輯部全體成員享用了一場(chǎng)行業(yè)領(lǐng)域的盛宴。

首先，編輯部對(duì)于雜志的創(chuàng)刊背景和創(chuàng)刊設(shè)想進(jìn)行了詳細(xì)的闡述，并對(duì)雜志的具體欄目做了介紹。隨后，專(zhuān)家們對(duì)雜志未來(lái)的發(fā)展方向、欄目?jī)?nèi)容的設(shè)定、雜志平臺(tái)的運(yùn)行提出了寶貴的意見(jiàn)和建議。其中主任委員、中國(guó)工程院院士俞建勇對(duì)于雜志的創(chuàng)辦進(jìn)行了充分的肯定，并強(qiáng)調(diào)稱(chēng)，在紡織服裝業(yè)中檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有著關(guān)鍵的作用，隨著紡織行業(yè)的多元化、綠色生態(tài)方面的發(fā)展，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方面也需要實(shí)時(shí)更新，以順應(yīng)時(shí)代的發(fā)展，希望雜志能夠在國(guó)際化、市場(chǎng)化、產(chǎn)業(yè)升級(jí)、生態(tài)性及技術(shù)升級(jí)方面能夠起到引領(lǐng)作用，雜志整體內(nèi)容呈現(xiàn)全面的基礎(chǔ)上，努力形成雜志專(zhuān)業(yè)特色。

解德誠(chéng)院長(zhǎng)總結(jié)時(shí)表示，自雜志創(chuàng)刊伊始即對(duì)其傾注殷切希望，目前在紡織制造工業(yè)加工總量穩(wěn)定的大勢(shì)下，若能把標(biāo)準(zhǔn)、檢測(cè)方法與市場(chǎng)需求有效地結(jié)合，就會(huì)看到一個(gè)巨大的市場(chǎng)。同時(shí)希望《紡織檢測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)》雜志越辦越好，成為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)領(lǐng)域內(nèi)獲取信息的重要渠道以及專(zhuān)業(yè)人士經(jīng)驗(yàn)共享的重要載體。

檢測(cè)技術(shù)

Optimized method of extracting genomic DNA in hemp and ramie bast fiber for PCR detecting

Bao Qi-bei1,2，You Jian-wu1，Qian Dan1，Ren Qing-qing1，F(xiàn)u Ke-jie1,2
（1.Ningbo Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Textile testing center,Zhejiang 315012,China; 2.Ningbo Academy of Science & Technology for Inspection & Quarantine,Zhejiang 315012,China）

Abstract:Two special sample groups including hemp bast fibers and hemp fiber were used as material,the effects of traditional CTAB,kit crude extraction and beads purification DNA extraction on extraction were compared.The results showed that the extracted DNA samples by kit crude extraction from hemp bast fiber could be used directly for PCR detecting.The treatment process of hemp fiber greatly impact the DNA quality in the fiber.With hemp fiber from raw jute to yarn and fabric,it was difficult to extract high-quality DNA sample.Although a certain amount of DNA can be extracted in these samples,the DNA sample could not be directly used for PCR detecting.

Key words:bast fiber，genomic DNA，extraction，PCR detecting

作者簡(jiǎn)介：保琦蓓（1982-），女，博士，工程師，E-mail：baoqibei@126.com，主要研究方向?yàn)樯鷳B(tài)紡織品檢測(cè)與研究。

項(xiàng)目基金：國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014IK178），浙江省自然科學(xué)基金（LQ13B070003）

收稿日期：2015-11-01

中圖分類(lèi)號(hào)：TS107

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-7046（2016）01-0007-05