經宿主致倦庫蚊幼蟲復壯后滅蚊真菌貴陽腐霉的毒力觀察*

楊　虓， 蘇曉慶

(1.珠海盈嘉行科技有限公司， 廣東 珠海　519000； 2.貴州醫科大學 生物學教研室， 貴州 貴陽　550004)

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經宿主致倦庫蚊幼蟲復壯后滅蚊真菌貴陽腐霉的毒力觀察*

楊虓， 蘇曉慶**

(1.珠海盈嘉行科技有限公司， 廣東 珠海519000； 2.貴州醫科大學 生物學教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 經宿主致倦庫蚊幼蟲復壯后滅蚊真菌貴陽腐霉(Pg)的毒力觀察。方法： 向高壓滅菌碗加入致倦庫蚊幼蟲和毒力減退的Pg菌絲，記錄蚊蟲死亡數和感染數，計算死亡率和感染率；取被感染的蚊蟲用水瓊脂平板、KPYG2平板和SFE平板分離Pg，用新分離的Pg感染致倦庫蚊幼蟲，記錄復壯后最高組感染率、單碗的最高和最低蚊蟲感染率，觀察Pg感染蚊蟲毒力的變化。結果： 復壯后最高組Pg對蚊蟲平均感染率、單碗Pg對蚊蟲最高感染率及單碗Pg對蚊蟲最低感染率均達到40%或以上，單碗Pg最高感染率甚至達100%。結論： 采用宿主致倦庫蚊幼蟲復壯毒力減退的Pg菌絲，可提高Pg滅蚊的毒力。

[關鍵詞]致倦庫蚊； 幼蟲； 復壯； 生物滅蚊； 貴陽腐霉； 毒力

蚊蟲是重要的醫學昆蟲，不僅吸血騷擾人畜，而且傳播瘧疾、登革熱、乙型腦炎等多種疾病。近年來，在廣東、云南、廣西、福建及臺灣等多地出現登革熱流行，消滅登革熱媒介昆蟲——蚊，變得迫在眉睫[1]。目前滅蚊多使用化學滅蚊劑，在導致嚴重的環境污染和破壞生態平衡的同時，還誘導了蚊蟲的抗藥性[1-3]。生物滅蚊是一種有利于環境保護和維持生態平衡的方法，但是，目前可用的生物滅蚊劑僅有滅蚊細菌蘇云金桿菌以色列變種(Bacillusthuringiensisvar.israelensis，Bti)和球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus, Bs)。Bti持效期太短，Bs滅登革熱媒介的能力弱(內部交流)，而滅蚊真菌(Pythiumguiyangense, Pg)則具有有較大優勢。Pg具有繁殖速度快、易于人工培養、滅蚊譜廣(3屬14種)、對非靶生物相對安全等諸多優點[4]，但亦存在毒力不穩定的缺點, 復壯是對已衰退的菌種(群體)進行純種分離和選擇性培養，使其中未衰退的個體獲得大量繁殖，重新成為純種群體的措施。2013年7月22日～12月14日，本研究采用經宿主復壯的方法提升Pg滅蚊毒力，報告如下。

1材料與方法

1.1材料

實驗用Pg真菌為1994年從貴州醫科大學(原貴陽醫學院)土壤中分離并在本實驗室保種、傳代所得。培養用SFE培養基和KPYG2培養基[5]，純化用水瓊脂培養基(1 000 mLddH2O中加入1.5 g瓊脂，高壓滅菌后鋪制平板)。實驗測試用蚊蟲為本實驗室馴養的2～3齡致倦庫蚊幼蟲。喂養條件：溫度(25±1)℃，光照條件L∶D=14∶10，相對濕度70%。

1.2方法

1.2.1Pg生物測定將Pg接種于新鮮SFE培養基，25 ℃培養5～7 d。取耐高溫塑料碗8只，高壓滅菌后，每碗盛200 mL自來水，加25只致倦庫蚊幼蟲、4%雞肝粉懸液8滴；均分為實驗組和對照組，實驗組加入帶菌絲的瓊脂塊(面積約為113 m2)3塊，對照組每碗加入3塊空白SFE瓊脂塊。每天觀察2次，取出死蚊，鏡檢感染情況；記錄蚊蟲死亡數和感染數，計算死亡率和感染率。死亡率或感染率=(蚊蟲死亡數或感染數/蚊蟲總只數)×100%，以對照組蚊蟲不出現死亡和感染為實驗可信。

1.2.2分離Pg取被感染的蚊蟲，用75%酒精消毒，無菌ddH2O洗3次，無菌濾紙吸干殘留水分，分別接種于水瓊脂平板、KPYG2平板和SFE平板，25 ℃培養5～7 d，用以感染新的蚊蟲。

1.2.3復壯用新分離的Pg感染致倦庫蚊幼蟲，從感染率高的實驗組中挑選菌絲生長茂盛、蟲體相對完好的蟲尸，或挑選帶菌還沒有死亡的活蟲來分離Pg。重復以上過程，通過計算感染率來反映Pg感染蚊蟲毒力的變化。

1.2.4觀察指標記錄復壯后平均感染率最高組、蚊蟲感染率最高和最低單碗的蚊蟲感染率，記錄被感染的活蚊數目，以最高組平均感染率為主要指標，其余指標作為輔助指標評價Pg感染蚊蟲的毒力。

2結果

2.1最高組Pg平均感染率

圖1　最高組Pg對蚊蟲平均感染率Fig.1　A curve showing changes of the highest group average infection rates in bio-assay of P. guiyangense during July through December 2013

因為長期在人工培養基上保種，Pg的滅蚊能力明顯下降，所致蚊蟲感染率經常在10%左右。經過復壯以后，最高組Pg對蚊蟲平均感染率有明顯的提升，從圖1可看出，在復壯前，最高組平均感染率在40%以下，復壯后，感染率迅速升至40%以上，最高超過80%。雖然復壯后出現一個低谷，但糾正后，最高組平均感染率達40%以上。后面雖有反復，但感染率的提高趨于穩定。

2.2單碗Pg最高感染率

單碗Pg對蚊蟲的最高感染率是Pg毒力上升的另一項指標。復壯后的單碗最高感染率高于復壯前， 復壯后的單碗最高感染率可達100%(圖2)。

2.3單碗Pg最低感染率

圖2　單碗Pg對蚊蟲最高感染率Fig.2　A curve showing changes of the highest cup infection rates in bio-assay of P. guiyangense during July through December 2013

從圖3可以看出Pg毒力呈提升的趨勢，復壯前出現一定的0感染率單個實驗碗，復壯后很少出現，最低單碗感染率可達80%。

圖3　單碗Pg對蚊蟲最低感染率Fig.3　A curve showing changes of the lowest cup infection rates in bio-assay of P. guiyangense during July through December 2013

3討論

菌種退化是微生物培養和生產中普遍存在的問題。其表現形式多種多樣，Pg菌種退化的主要表現就是滅蚊毒力下降。對于菌種退化的原因，學者們舉出很多，涉及到生理、生化方面，也有病毒干擾以及培養條件等。但其中最重要的是遺傳因素起的作用，或者說遺傳因素通過前述的各因素導致了菌種的退化[6-7]。

引起菌種退化的遺傳因素包括基因突變、基因重組、染色體突變、遺傳平衡被打破等。對于Pg這種多核細胞真菌，異核體現象能更好地解釋其退化的原因[7]。在其生長繁殖過程中，反復的有絲分裂和減數分裂必然形成具有不同基因組合，和不同表達基因的細胞核。其各種核的比例不斷變化，表現為滅蚊毒力較大幅度的波動。長期在人工培養基上繼代培養，使比較適應于腐生的基因表達的細胞核逐漸占優勢，因此其對蚊蟲的毒力明顯下降。而在連續的經宿主復壯過程中，不斷篩選毒力高的菌株，即增加適應于寄生的基因表達的細胞核所占比例。因此獲得比較明顯的滅蚊毒力增高的效果。實驗中還觀察到隨著菌株毒力增高，帶菌活蟲數目明顯增加。而低毒力的菌株感染的蚊幼蟲被發現時已經是長滿菌的蟲尸。課題組推測原因可能為當Pg的毒力增強后，Pg就能快速地侵入蟲體，在蟲體明顯發病前就生長繁殖。而當它毒力比較弱時，Pg的入侵和生長速度比較慢，蚊蟲的感染和死亡發生得也比較緩慢而不明顯。當采用被感染的活蟲進行復壯，后代菌株的感染能力會比從感染蚊尸中分離得到的菌株高，可能是因為適應于寄生的基因表達所占比例增高，進一步驗證了該假設。

Pg能否應用于滅蚊防病，提高和穩定Pg的毒力是關鍵的環節。雖然基因工程[8]和原生質體育種[9]是改良菌種的有力工具，但是相比之下，傳統的經宿主復壯方法，更簡單、易行，效果明顯，不失為經濟實用的手段。本實驗結果顯示Pg復壯后最高組Pg平均感染率、單碗Pg最高感染率及單碗Pg最低感染率均達到40%或以上，單碗Pg最高感染率甚至達100%，說明本復壯實驗成功使毒力減退的Pg通過復壯恢復了毒力，雖然復壯過程中，不良的培養基材料導致了一次反復，證明了培養條件也是影響菌種毒力的因素。這對于實際生產也提供了有益的經驗。長期在人工培養基上傳代會導致菌種退化，提示在Pg的工業化生產中必須加強菌種的復壯工作。經宿主復壯是保持和提高Pg毒力的有效途徑。

4參考文獻

[1] 孟鳳霞，王義冠，馮磊,等. 我國登革熱疫情防控與媒介伊蚊的綜合治理 [J].中國媒介生物學及控制雜志, 2015(1)：4 -10.

[2] 趙明惠，冉鑫，李春曉,等 淡色庫蚊和致倦庫蚊對殺蟲劑抗藥性的調查研究[J].中國媒介生物學及控制雜志, 2014(2)：116-118.

[3] 蔡蓉，邵宗賢，陳躍,等. 淮安市三帶喙庫蚊和白紋伊蚊對常用殺蟲劑的抗藥性測定 [J]. 中華衛生殺蟲藥械, 2015(1)：23-25.

[4] 蘇曉慶，劉萍，張傳博,等.滅蚊真菌貴陽腐霉及其研究進展[J].中華衛生殺蟲藥械, 2010(2)：141-143.

[5] 王榮新，雷大衛，蘇曉慶. 貴陽腐霉Pr1蛋白酶的誘導條件研究[J]. 貴陽醫學院學報, 2008(1)：12-15.

[6] 劉新宇，祁玉良，熊在東,等.食用菌菌種退化的遺傳學分析[J] .信陽農業高等專科學校學報, 2001(2)：16-18.

[7] 唐曉慶，唐燕平，李增智. 球孢白僵菌菌種退化及其對馬尾松毛蟲防治的影響 [J]. 安徽農業大學學報, 1996(3)：246-253.

[8] Zhao JN, Su XQ.The genetic transformation ofPythiumguiyangensemediated byAgrobacteriumtumefaciens[J] Mycosistema, 2008(4):594-600.

[9] 江梅，蘇曉慶. 滅蚊真菌貴陽腐霉原生質體誘變育種實驗研究[J].貴陽醫學院學報, 2008(6)：586-596.

(2015-12-03收稿，2016-02-25修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 周凌

An Observation on Virulence of Mosquito-killing Fungus,Pythiumguiyangenseafter Rejuvenated through Its Host,CulexquinquefaciatusLarvae

YANG Xiao1, SU Xiaoqing1,2

(1.YingjiahangS.T.Co.LTD,Zhuhai519060,Guangdong,China; 2.DepartmentofBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To observe the virulence of mosquito-killing fungus, Pythium guiyangense (Pg) after being rejuvenated through its host, Culex quinquefaciatus larvae. Methods: Bioassay was conducted by adding Pg mycelia with its host C. quinquefaciatus larvae into disinfected plastic containers, recording numbers of dead and infected larvae, and calculating mortality rates and infection rates. Pg was re-isolated from infected larvae using KPYG2, SFE and water agar plates, and used to infect C. quinquefaciatus larvae again. The mortality rates and infection rates, specially infection rates in groups and in individual containers were calculated and compared. Results: After several times of continuous rejuvenation, C. quinquefaciatus larvae infection rates by Pg increased markedly, including the highest group infection rates and the highest and lowest infection rates in individual containers, which were generally up to 40% or above, specially, an infection rate of 100% was achieved in individual container. Conclusion: Rejuvenation through host is an effective way to increase virulence of Pg to mosquitoes.

[Key words]Culex quinquefaciatus; larva; rejuvenation; mosquito biological control; Pythium guiyangense Su; virulence

[中圖分類號]R184.31; R379; Q939.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)03-0261-04

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No：30760140)

**通信作者 E-mail:su.xiaoqing@aliyun.com

網絡出版時間：2016-03-17網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160317.1008.006.html