加蘭他敏對心肌缺血再灌注損傷大鼠血清CK-MB活性及TNF-α和IL-6水平的影響*

李　卉， 馬　敏， 咸淑悅， 王焱林

(武漢大學中南醫院 麻醉科， 湖北 武漢　430071)

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加蘭他敏對心肌缺血再灌注損傷大鼠血清CK-MB活性及TNF-α和IL-6水平的影響*

李卉， 馬敏， 咸淑悅， 王焱林**

(武漢大學中南醫院 麻醉科， 湖北 武漢430071)

[摘要]目的： 探討加蘭他敏對心肌缺血再灌注損傷(MIRI)大鼠血清肌酸激酶(CK-MB)活性和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)水平的影響。方法： SPF級雄性SD大鼠50只，隨機均分為假手術組、心肌缺血再灌注(I/R)組、加蘭他敏組、聯合A組及聯合B組；在5組大鼠左冠狀動脈前降支(LAD)下穿線，假手術組穿線不結扎，其余4組大鼠穿線后結扎LAD 30 min后，再松開結扎線再灌注120 min，制作I/R模型，假手術組及I/R組造模前30 min靜脈注射生理鹽水(2 mL/kg)，其余3組注射加蘭他敏(4 mg/kg)，聯合A組在造模前45 min還注射阿托品(4 mg/kg)、聯合B組在造模前45 min還切斷兩側迷走神經；5組大鼠再灌注120 min后，測定大鼠血清CK-MB活性及TNF-α、IL-6水平，取心肌組織進行HE染色，光鏡下觀察心肌結構。結果： 與假手術組比較，I/R組CK-MB活性、TNF-α及IL-6水平升高(P<0.05)，提示造模成功；與I/R組比較，加蘭他敏組CK-MB活性、TNF-α和IL-6水平降低(P<0.05)；與加蘭他敏組比較，聯合A組及聯合B組CK-MB活性、TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05)；400×光鏡視野下見假手術組心肌纖維排列整齊，I/R組心肌結構紊亂，可見細胞壞死和炎性細胞浸潤，加蘭他敏組心肌纖維排列較整齊，僅見水腫和少許炎性浸潤，聯合A組及聯合B組心肌細胞排列紊亂，心肌水腫，組織間隙有炎性細胞浸潤。結論： 加蘭他敏可能通過膽堿能抗炎通路減少炎性因子的產生，從而減輕心肌MIRI。

[關鍵詞]加蘭他敏； 心肌再灌注損傷； 膽堿能抗炎通路； 細胞因子

心肌缺血再灌注損傷( Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury，MIRI)是阻礙缺血心肌得到有效治療的難題。加蘭他敏是一種膽堿酯酶抑制劑，對膿毒癥有治療作用，其機制可能是作用于以迷走神經及其遞質乙酰膽堿為核心的膽堿能抗炎通路(Cholinergic anti-inflammatory pathway)，從而產生抗炎效應[1]。心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)過程有典型的炎癥反應表現[2]，本研究探討加蘭他敏對心肌I/R過程中炎癥反應的影響。

1材料與方法

1.1動物選擇、分組及處理

50只SPF級雄性SD大鼠，體質量225～275 g(湖北省武漢大學動物實驗中心提供)，隨機均分為假手術組、I/R組、加蘭他敏組、聯合A組及聯合B組。I/R組、加蘭他敏組、聯合A組及聯合B組均穿線結扎大鼠左冠狀動脈前降支(LAD)30 min后，松開結扎線再灌注120 min制作I/R模型，假手術組僅絲線從LAD下方穿過但不結扎；假手術組、I/R組在造模前30 min經大鼠股靜脈緩慢注射生理鹽水(2 mL/kg)，加蘭他敏組注射加蘭他敏(4 mg/kg)，聯合A組和聯合B組按加蘭他敏組處理外，造模前45 min聯合A組給予阿托品4 mg/kg、聯合B組切斷雙側頸迷走神經。

1.2制作I/R模型

SD大鼠稱重，以1%戊巴比妥鈉按50 mg/kg腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定于手術臺，頸前正中切口行氣管切開，插自制氣管導管，接DW-2000型動物人工呼吸機(上海嘉鵬科技有限公司)行機械通氣，潮氣量20 mL/kg，呼吸頻率60次/min。連續監測大鼠標準Ⅱ導聯心電圖。股靜脈穿刺置管，用于給藥及補液。于大鼠胸骨左緣第3～4肋間開胸，暴露心臟，剪開心包膜，在LAD距左心耳下緣約2 mm處穿線，平衡15 min后，活結結扎阻斷LAD血流， 30 min后松開結扎線再灌注120 min。以結扎后心電圖ST段明顯上抬，結扎線遠端心肌顏色先變白后變暗判為心肌缺血；以再灌注后缺血區心肌變紅、抬高的S-T段回落和QRS波振幅逐漸降低判為為再灌注成功。

1.3檢測指標

大鼠再灌注120 min時處死大鼠，取大鼠靜脈血2 mL，4 ℃ 3 000 r/min離心收集血清，按試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書檢測肌酸激酶(CK-MB)活性，按ELISA試劑盒(R&D公司)說明書檢測大鼠血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)的水平；取大鼠心肌組織包埋切片HE染色，400×光鏡下觀察各組心肌組織結構。

1.4統計學處理

2結果

與假手術組比較，I/R組CK-MB活性和TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)，證實造模成功；與I/R組比較，加蘭他敏組CK-MB活性、TNF-α及IL-6水平降低(P<0.05)；與加蘭他敏組比較，聯合A組及聯合B組CK-MB活性、TNF-α及IL-6水平升高(P<0.05)，見表1。光鏡下觀察心肌組織結構發現假手術組心肌排列整齊，I/R組心肌排列紊亂、心肌水腫、可見心肌壞死融解，炎性細胞浸潤；加蘭他敏組心肌排列較整齊，有組織水腫，但未見心肌壞死，炎性細胞浸潤輕；聯合A組及聯合B組心肌細胞排列紊亂，心肌水腫，組織間隙有炎性細胞及血細胞浸潤。見圖1。

表1　各組大鼠血清CK-MB活性和

(1)與假手術組比較，P<0.05；(2)與I/R組比較，P<0.05；(3)與加蘭他敏組比較，P<0.05

注：A為假手術組，B為 I/R組，C為加蘭他敏組，D為聯合A組，E為聯合B組圖1　各組大鼠心肌組織結構(HE，×400)Fig.1　The cardiac muscle fiber structure in each group

3討論

加蘭他敏是一種可以透過血腦屏障的膽堿酯酶抑制劑，臨床用于治療阿爾茨海默病，可以通過中樞毒蕈堿膽堿能受體激活膽堿能抗炎通路，降低內毒素血癥時促炎性細胞因子TNF-α和IL-1等的水平[1]。炎癥在心肌MIRI的發生發展中起著重要的作用，使用抗炎療法可以減輕心肌MIRI[2-3]。近年來發現的膽堿能抗炎通路是一條通過迷走神經及其遞質乙酰膽堿為主的膽堿能系統，可通過神經系統直接調控機體的免疫系統[4]。與傳統的體液抗炎通路相比，膽堿能抗炎通路具有作用范圍廣泛靈敏、調控迅速的特點[5-6]。有研究報道，使用電刺激迷走神經或者藥物激活膽堿能抗炎通路可以降低感染性休克、風濕性關節炎和MIRI中血清及組織促炎性細胞因子TNF-α、IL-1、IL-6的水平，對組織器官產生保護作用[5，7-8]。TNF-α是心肌MIRI機制中的關鍵細胞因子，不僅有直接的細胞毒性作用和心肌抑制作用，還可以通過啟動其他促炎性細胞因子如IL-1和IL6的產生和釋放，觸發血小板激活等途徑損害心肌功能，促進心肌MIRI，減少TNF-α產生可以減輕心肌MIRI[9-12]。本研究中，與假手術組比較，I/R組大鼠心肌結構破壞嚴重，CK-MB增高， TNF-α和IL-6水平升高，證明I/R模型復制成功。使用加蘭他敏預處理I/R模型大鼠后，與假手術組比較，大鼠心肌結構損傷減輕，血清CK-MB活性和TNF-α、IL-6水平明顯降低(P<0.05)，說明加蘭他敏可通過降低促炎性細胞因子水平，對心肌MIRI大鼠的心肌起到保護作用。而與加蘭他敏組比較，聯合A組和聯合B組CK-MB活性、TNF-α及IL-6水平升高(P<0.05)，說明阿托品或者切斷迷走神經可以消減加蘭他敏對心肌MIRI大鼠的心肌保護作用，提示加蘭他敏的保護作用與迷走神經及毒蕈堿型膽堿能受體有關。

綜上，加蘭他敏可能通過激活膽堿能抗炎通路、減少促炎性細胞因子的產生來減輕心肌I/R大鼠的心肌損傷，加蘭他敏對治療心肌MIRI起一定的作用。

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(2015-12-20收稿，2016-02-25修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 劉華

Effects of Galantamine on Serum CK-MB activity, TNF-α Level and IL-6 Level of Rats with Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury

LI Hui, MA Min, XIAN Shuyue, WANG Yanlin

(DepartmentofAnesthesiology,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,Hubei,China)

[Abstract]Objective: To explore the effect of galantamine on serum CK-MB activity, TNF-α level and IL-6 level of rats with MIRI. ethods: Fifty male SD rats were randomly divided into 5 groups (n=10) : group A (sham operation), group B (ischemia/reperfusion, I/R), group C (galantamine+I/R), group D (atropine+galantamine+I/R), group E (bilateral cervical vagotomy+galantamine+I/R). The rat ischemia/reperfusion injury model was established by ligation of left anterior coronary descending branch (LAD) for 30 min followed by reperfusion for 120 min. Group A (sham operation), group B (ischemia/reperfusion, I/R ) were injected with physiological saline 30 min before model building (2 mL/kg) while other groups were injected with galantamine (4 mg/kg). Group D was injected with atropine 45 min before model building (4 mg/kg) besides galantamine injection and in group E bilateral cervical vagotomy of rats were cut off besides galantamine injection. 120 min after reperfusion, serum CK-MB activity, TNF-α and IL-6 level were measured. The myocardial tissue was collected to make HE staining, and the myocardial structure was observed under optical microscope. Results: Compared with group A (sham operation), the serum CK-MB activity, serum levels of TNF-α and IL-6 were significantly increased in group B(I/R), P<0.05, suggesting that I/R model was successfully constructed. Compared with group B(I/R), the serum CK-MB activity, serum levels of TNF-α and IL-6 in group C (galantamine+I/R) were significantly decreased (P<0.05). Compared with group C (galantamine+I/R), the serum CK-MB activity, serum levels of TNF-α and IL-6 in group D (atropine+galantamine+I/R) and group E (bilateral cervical vagotomy+galantamine+I/R) were increased significantly (P<0.05). Under 400×optical microscope, cardiac muscle fibers arranged neatly in group A (sham operation) while myocardial structure was in disorder, and meronecrobiosis and inflammatory cell infiltration could be seen in group B(I/R). In group C (galantamine+I/R), cardiac muscle fibers arranged neatly, and hydroncus and inflammatory cell infiltration could be seen to some extent while in group D and group E myocardial structure was in disorder, and myocardial edema and inflammatory cell infiltration in interstitial space could be seen. Conclusion: Galantamine may attenuate the myocardial I/R injury by inhibiting the production of inflammatory cytokines through cholinergic anti-inflammatory pathway.

[Key words]galantamine; myocardial reperfusion injury; cholinergic anti-inflammatory pathway; cytokines

[中圖分類號]R542.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)03-0280-04

*[基金項目]中央高校基本科研業務費專項資金、武漢大學自主科研資助(No.410500181)

**通信作者 E-mail:wyl0342@sina.com

網絡出版時間：2016-03-17網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160317.1051.042.html