臺東蘇鐵中葉綠體功能基因RNA編輯的分析

沈成才

(北京師范大學克拉瑪依附屬學校,新疆 克拉瑪依 834000)

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臺東蘇鐵中葉綠體功能基因RNA編輯的分析

沈成才

(北京師范大學克拉瑪依附屬學校,新疆 克拉瑪依 834000)

摘要：臺東蘇鐵是一種古老的裸子植物，有關蘇鐵的RNA編輯的研究很少。為此，我們分析了臺東蘇鐵的RNA編輯位點和分布，為探究RNA編輯的功能和機制以及高等植物的起源和進化提供依據。本次以臺東蘇鐵(Cycas taitungensis)為材料，采用異硫氰酸胍法提取臺東蘇鐵總RNA。DNaseⅠ處理過的RNA 逆轉得到的cDNA進行PCR擴增條帶并測序。通過對測序結果分析比對，初步確定在臺東蘇鐵中的ndhD2，PetB，ndhB2存在C-U 的編輯。研究表明，ndh基因有較高的編輯頻率，而絲氨酸相比其他氨基酸有更高的編輯頻率。結果顯示，ndhB2中有C-Y的部分編輯現象，ndhA2存在沉默編輯現象。

關鍵詞：臺東蘇鐵；RNA編輯；RNA 提取；異硫氰酸胍法

RNA編輯是指轉錄后RNA成熟過程中的堿基的插入、缺失和替換等修飾和加工的過程，使得 RNA所攜帶的遺傳信息發生改變，從而導致蛋白質序列的改變的過程[1]。RNA編輯廣泛存在于動植物及微生物中，在葉綠體、線粒體和細胞核基因中均可發生，根據編輯效率的不同可分為沉默編輯、部分編輯和完全編輯三種[2]。葉 綠 體 的 RNA 編輯在高等植物中是廣泛存在的，并在葉綠體基因的表達與調控方面起著重要的作用，是擴展原有遺傳信息、增加基因表達調控途徑的一種有效方式[3]。RNA編輯 還能夠通過提高氨基酸的保守性來影響蛋白質的結構，進而影響其功能的發揮[4]。葉綠體RNA編輯具有組織特異性和發育階段特異性，并受外界環境影響。目前, 已經測定葉綠體RNA編輯位點的高等植物有豌豆[5]、煙草[6]、擬南芥[7]、番茄[8]、角苔[9]、鐵線蕨[10]、蝴蝶蘭[11]、黃瓜[12]、棉花[13]、小麥[14]、菠菜[15]、玉米、水稻 、甘蔗、黑麥、大麥[16]、粗山羊草等，研究發現高等植物葉綠體中的RNA編輯主要以胞嘧啶轉換成尿嘧啶的形式存在，且主要發生在密碼子的第一、二位堿基，往往造成親水性氨基 酸轉變為疏水性氨基酸。目前，葉綠體RNA編輯位點的鑒定方法主要有生物信息學預測、高通量測序和PCR擴增等方法[17]。

目前，有關葉綠體RNA編輯的模型以及相關進化問題取得了較大進展，但裸子植物中關于葉綠體RNA編輯的研究的報道僅見于黑松[18]和銀杏[19]等少數植物。現代裸子植物約有800種，隸屬5綱即蘇鐵綱、銀杏綱、松柏綱、紅豆杉綱和買麻藤綱。蘇鐵(CycasrevolutaThunb)，蘇鐵科蘇鐵屬，又名鳳尾蕉、避火蕉、金代、鐵樹等，蘇鐵科植物是世界上最古老的裸子植物，被地質學家譽為“植物活化石”[20]。有關蘇鐵RNA編輯的研究不多，李璐等人在常規的CTBA法中，加入了硼砂和β-巰基乙醇來消除多酚和多糖的干擾，從而得到了一個從蘇鐵葉片中有效提取 RNA 的方法[21]。臺灣生物中央研究所趙淑妙教授預測臺東蘇鐵中psbL基因只有一個RNA編輯位點，其它基因中沒有RNA編輯現象[22]。江媛、陸萍等人認為，臺東蘇鐵的葉綠體基因組中有40個蛋白編碼基因有RNA編輯現象，在植物進化中，RNA編輯正在逐漸消失且密碼子的第一、三位消失的更快，臺東蘇鐵的葉綠體基因組的RNA編輯位點比線粒體少三倍[23]。

現階段，對蘇鐵RNA編輯的研究較少，并且傾向與理論預測水平。計算機預測快速方便，但結果可能與真實情況存在偏差，也無法預測第三位的沉默編輯。從已有文獻報道以及銀杏編輯位點的分析，表明裸子植物中有較多RNA編輯現象。因此，本次通過實驗手段并結合生物信息學的方法，對蘇鐵葉綠體8個功能基因進行RNA編輯位點的分析，確定蘇鐵中是否有無RNA編輯現象，為進一步全面了解蘇鐵葉綠體中功能基因全部編輯位點及其特點奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗材料

臺東蘇鐵(Cycastaitungensis)，購買于西安三森花卉市場。

1.1.2實驗試劑

GT溶液(4 mol/L異硫氰酸胍，25 mmol/L檸檬酸鈉，0.5%十二烷基肌氨酸鈉)；

10×TBE電泳緩沖液(108 g Tris; 55 g硼酸；9.3 g EDTA2Na;1 000mL;PH8.0)；1%瓊脂糖凝膠 (0.2 g瓊脂糖；1×TBE緩沖液20 mL；2 μ EB)；3 mol/L NaAc(pp.8)，2 mol/L NaAc (ph1.8)，4 mol/L LiCl，0.1﹪ DEPC水。無水乙醇、液氮、氯仿、水飽和酚酸、RT-PCR Kit、DNA酶等。

1.1.3實驗儀器

DYY-12型電泳儀；PB-10型PH計；BS-124S型電子天平；YDS-30型液氮生物容器；DSX-280A型不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋；JB-3定時恒溫磁力攪拌器；DYCP-31DN電泳槽；ALS1296型PCR儀；Centrifuge 5804R型臺式冷凍離心機；Centrifuge 5417C型臺式高速離心機；AGX-7601型通風廚；精密微量移液器；GDS-8000型凝膠成像系統；UNICAM UV300型紫外分光光度計；HH-2B型數顯恒溫水浴鍋； DW-86L368型超低溫冰箱；GZX-9140MBE型數顯鼓風干燥箱；PE手套，離心管，PCR管，槍頭。

1.2方法

1.2.1異硫氰酸胍法提取植物葉片總RNA

(1) 稱取0.1 g新鮮植物葉片，加入液氮研磨成粉末，移入預冷的1.5 mL Eppendorf管中。

(2)加入300 μL GT溶液，混勻；加入30 μL 2mol/L NaAc(pH 4.8)，反復振蕩混勻；加入300 μL酚酸與100 μL氯仿，混勻。

(3)4 ℃，8 000 r/min離心15 min，棄沉淀，取上清移至另一DEPC水處理過的干凈離心管中，加入2.5倍體積無水乙醇，-20 ℃放置5～6 h。 (-20 ℃可放置過夜)

(4) 4 ℃，8 000 r/min離心15 min，棄上清液。在沉淀中加入100 μL 4 mol/L LiCl，使沉淀溶解。

(5) 12 500 r/min離心15 min，棄上清液；在沉淀中加入100 μL滅菌后的DEPC水，混勻后再加入50 μL氯仿，50 μL水飽和酚混勻。

(6)12 500 r/min離心5 min，吸上清液移至另一DEPC水處理過的1.5 mL Eppendorf管，加入等體積氯仿。

(7)12 500 r/min離心5 min。吸上清液移至另一DEPC水處理過的1.5 mL Eppendorf管，加入1/10體積3 mol/L NaAc (pH 5.8)和兩倍體積無水乙醇，-20 ℃放置過夜。

(8)12 500 r/min離心5 min，小心吸去上清，RNA沉淀在室溫下稍干燥。

(9)加入20 μL DEPC處理過的滅菌水溶解，取5 μL樣品經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(100v,100 mA,20 min) RNA質量，并取2 μL樣品加入498 μL DEPC處理過的水，用紫外分光光度計測定RNA濃度；其余樣品-20℃保存備用。

1.2.2待擴增基因引物設計

確定RNA編輯位點較多的8個基因，psbL、psbF、psbE、PetB、PetD、ndhB、ndhA、ndhD，從NCBI上查出臺東蘇鐵Cycastaitungensis(序列號[NC-009618])全部葉綠體DNA序列和cDNA序列，選取編碼框前后100 bp處的核苷酸序列，用相關軟件設計并合成引物。

引物名稱及序列見表1。

設計引物所用到的軟件有：

http://www.sigmagenosys.com/calc/DNAcalc.asp

http://www.bioinformatics.vg/bioinformatics_tools/reversecomplement.shtml

表1　引物名稱及序列

1.2.3RT-PCR擴增

用RNase-free的DNaseI去除混雜在總RNA中的基因組DNA，采用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄(具體操作按照試劑盒說明書進行)，用3 μL的RNA為模板，對逆轉得到的cDNA，進行PCR擴增。PCR反應體系2 μL 臺東蘇鐵的cDNA, 12.5 μL 2 ×TaqPCR Mix，上、下游引物各2 μL,用水補足至25 μL。反應程序如下: 95 °C 3 m； 95 °C 1 m， 55 °C 1 m， 72 °C 1 m, 30個循環；72 °C延伸10 m。PCR擴增產物于4 °C保存。取2 μL樣品經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(100 v，100 mA，20 min)PCR擴增條帶。

1.2.4測序結果分析比對

采用Lesergene中seqman軟件對測序結果拼接和分析，并用ClastW軟件比對臺東蘇鐵DNA和cDNA序列，確定RNA編輯位點。

ClastW 軟件來自于http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html

Translate Tool 軟件http://ca.expasy.org/tools/dna.html

2結果和分析

2.1RT-PCR擴增

通過查閱國內外文獻，確定了葉綠體中8個發生RNA編輯現象可能性比較大的基因，即：psbL、psbF、psbE、PetB、PetD、ndhB、ndhD和ndhA。并對這8個基因設計引物，進行RT-PCR擴增。結果psbL、psbF、psbE和ndhB1未擴增出條帶，原因待查。圖1顯示其余基因均擴增結果良好，為單一條帶。其中PetD雖然擴增出條帶(圖1泳道2)，但分子量大小與預期結果不符，可能不是想要擴增的條帶，故舍去。ndhD1和ndhA1在同等PCR擴增條件下得到的條帶很淡(圖1泳道4和7)，在加大cDNA的用量之后，得到了符合測序的條帶，但測序結果顯示ndhD1和ndhA1的測序信號中斷，無結果。可能是由于送去測序的樣品中所含雜質較多，或測序本身的問題所造成。上述PCR擴增結果表明擴增條帶好壞與引物設計，模板用量以及PCR體系的優化均有密切關系，而測序結果則與樣品濃度，公司測序反應有關。

圖1　PCR擴增條帶的電泳結果Fig.1　Electrophoresis result of PCR amplification bands

2.2測序結果分析

經RT-PCR擴增和測序最終得到了PetB、ndhB2、ndhD2和ndhA2的cDNA測序結果。通過與NCBI所查到的臺東蘇鐵DNA的序列分析比對，從表2可知在ndhD2的五個位( 34，400，469，570，706 bp)存在C-U的完全編輯現象，對應Pro-Leu，Ser-Phe，Ser-Phe，His-Tyr，Thr-Ile的氨基酸轉變；在PetB的634bp位點存在 C-U的完全編輯，造成Pro到Ser氨基酸轉變；在ndhA第二外顯子350 bp位點存在U-Y沉默編輯；在ndhB2的203位點發生C-Y部分編輯, 同時404，509，533，695位點存在C-U的完全編輯，對應造成Ser-X，Ser-Leu，Ser-Leu，Pro-Leu，Thr-Ile氨基酸的轉變。ndhB2位點533的完全編輯與203的部分編輯比較見圖2和圖3。經過對蘇鐵葉綠體中的ndhD2、PetB、ndhA和ndhB的編輯位點的分析，初步確定在臺東蘇鐵中存在完全編輯、沉默編輯和部分編輯現象，且核苷酸的轉換有C-U的轉變方式。

3討論與結論

本文采用異硫氰酸胍法獲取臺東蘇鐵的總RNA，成本低且效果好。經RT-PCR擴增和測序比對，得知臺東蘇鐵葉綠體功能基因中存在完全編輯、沉默編輯和部分編輯現象。其中ndhD2的五個位點存在C-U的RNA完全編輯；在PetB的位點存在1個 C-U的完全編輯；在ndhA第二外顯子350 bp位點存在U-Y沉默編輯；在ndhB2的203位點發生C-Y部分編輯, 同時有4個位點存在C-U的完全編輯。

表2　臺東蘇鐵中四個葉綠體基因的編輯前后核苷酸和氨基酸變化的統計結果

圖2　ndhB2完全編輯Fig 2　Completely editing sites in ndhB2

圖3　ndhB2部分編輯 Fig 3　Partial editing sites in ndhB2

這說明臺東蘇鐵葉綠體功能基因存在RNA編輯現象，大部分編輯呈現C-U的轉變，ndh類基因中RNA編輯發生頻率較高，并且絲氨酸相比其他氨基酸有更高的編輯頻率。這一結論與江媛、陸萍等人的研究具有一致性，在petB的完全編輯和ndhD有5個完全編輯位點方面的研究結果也是具有一致性[23]。測序結果顯示ndhB有4個位點完全編輯與1個位點部分編輯，ndhA有一個沉默編輯位點，這與陸萍等人的研究中提到ndhB僅有一個完全編輯位點且ndhA中未出現沉默編輯的結論不一致，這可能與材料的選擇、不同發育階段以及環境因素有關，有待進一步研究。

RNA編輯是高等植物葉綠體轉錄本成熟過程中的一種重要修飾和加工方式。RNA編輯使人們對生物的長期進化中所形成的遺傳信息表達和調控機制有了一定的認識，也加深了對復雜的生命現象的認識。已有研究表明，RNA編輯位點在進化過程中呈減少趨勢，但一些重要的位點會繼續保留[24]。臺冬蘇鐵中的ndhB的部分編輯位點是調控基因表達的一種方式，還是進化過程中會消失的位點, 有待進一步的研究。ndhA中存在沉默編輯位點，而近年來對于沉默編輯功能的認識也存在爭議。Hirose等人認為沉默編輯與葉綠體的照光程度和發展階段相關[25]；Nakamura和Sugiura的研究表明, 葉綠體基因組存在密碼子的偏好性, 沉默編輯會影響蛋白質翻譯的效率[26]；也有學者認為沉默編輯似乎是多余的，在今后的進化過程中會消除[27]。

總之，RNA 編輯不但使編碼基因組的遺傳信息得到了擴增，同時對基因的表達產物有所影響。目前對 RNA 編輯的機制還不完全清楚，尤其是臺東蘇鐵屬于較古老的裸子植物，對其葉綠體RNA 編輯的研究具有一定的生物學意義。為進一步全面了解蘇鐵葉綠體中功能基因全部編輯位點的特點和功能奠定了基礎，也為研究生物進化方面提供一定的參考價值。

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Analysis of RNA editing sites in the chloroplast genome ofCycastaitungensis

SHEN Chengcai

(KaramaySchoolAttachedToBeijingNormalUniversity,KaramayXinjiangUygurAutonomousRegion834000,China)

Abstract：Cycas taitungensis is ancient gymnosperms,and the research of RNA editing in Cycas is limited.We analyzed the composition and distribution of RNA editing in Cycas taitungensis,which provided the useful information for exporing the function and mechanism of RNA editing,as well as for revealing the origin and evolution of higher plants.The thiocyanate method is appropriate for the RNA extraction of Cycas taitungensis. The cDNA was obtained by reverse transcribed the DNA-free RNA which treated with DNase.The RNA editing sites were found by RT-PCR,sequence and blast DNA and cDNA. Our results showed that the conversion of C-to-U and C-to-U editing events could be found in the ndhD2 and PetB transcripts of Cycas taitungensis as well as in ndhB(2 )transcript. We found that ndh genes have a higher rate of editing,while the serine codon was more frequently edited than the others.The results showed that there is a partially editing sites in ndhB(2 ) transcrip,and silence editing sites also could be found in the ndhA2 transcript.

Keywords：Cycas taitungensis；RNA editing；RNA extraction；Guanidine thiocyanate.

中圖分類號：Q51

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5565(2016)01-013-06

doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.01.03

作者簡介：沈成才，女，中教一級，研究方向：生物技術； E-mail: shencc_1@sina.cn.

收稿日期：2015-04-29；修回日期：2015-11-23.