實時熒光定量PCR定量檢測山核桃干腐病病菌潛伏侵染量方法的建立

朱致翔，時浩杰，雷飛斌，張傳清（浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江臨安311300）

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實時熒光定量PCR定量檢測山核桃干腐病病菌潛伏侵染量方法的建立

朱致翔，時浩杰，雷飛斌，張傳清
（浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江臨安311300）

摘要：由茶麋子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea引起的山核桃Carya cathayensis干腐病是山核桃栽培過程中的主要病害，該病菌表現明顯的“潛伏侵染”特性。研究山核桃樹體中干腐病菌的定量檢測技術對山核桃干腐病的預測預報及科學防治具有重要的指導意義。根據茶麋子葡萄座腔菌的EF1α基因設計特異性引物，通過普通聚合酶鏈式反應（PCR）和實時熒光定量PCR（real-time PCR）擴增發現引物EFRT-F1/R1對山核桃干腐病病菌的特異性及擴增效率較高，可穩定擴增出230 bp的目標條帶。應用此特異性引物建立的實時熒光定量PCR干腐病病菌檢測方法能夠定量檢測出山核桃植株樣品中的病菌含量，靈敏度要比普通PCR高100倍。圖6參8

關鍵詞：森林保護學；山核桃干腐病；實時熒光定量PCR；特異性引物；基因組DNA

山核桃Carya cathayensis又名核桃楸、胡桃楸，胡桃科Juglandaceae山核桃屬Carya植物。山核桃的果實種仁極富營養價值和口感，深受消費者喜愛，具有很高的經濟價值。山核桃干腐病是山核桃在栽培生產過程中一種常見的病害，染病植株產量會明顯下降，嚴重時可造成植株死亡，影響農戶收益［1］。山核桃干腐病菌Botryosphaeria dothidea屬子囊菌綱Ascomycetes葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae葡萄座腔菌屬Botryosphaeria［2］。葡萄座腔菌屬的特性多為子座散生，內含多個子囊殼，殼壁黑褐色，子囊殼呈球形或近球形，頂端具乳頭狀突起，孔口外露；子囊黑褐色倒棒狀，內含8個子囊孢子。子囊孢子梭形，無色透明，單胞，橢圓形，雙列，大小（16.8～26.4）μm×（7.0～10.0）μm。山核桃干腐病的發病期為每年的3月下旬至11月下旬，以菌絲體在病組織周圍越冬，具有明顯的潛伏侵染特性［3］。干腐病菌全年存在于樹體內，而明顯癥狀需要等到4-5月才能表現出來，如果等出現癥狀時才開始進行防治，有可能達不到預期效果。實現山核桃干腐病的早期、準確、快捷地定量測定對山核桃干腐病病害的預測預報和防治有極其重要的意義。利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time flurescent quantitive PCR）技術可以對DNA目的片段進行實時檢測，在PCR體系中添加特定的熒光結合物質或者熒光探針，受體熒光染料發射出的熒光信號強度與DNA產量成正比，通過檢測熒光信號的變化來監測PCR反應過程，從而達到定量目的［4-5］。通過實時熒光定量PCR技術可在病害的潛伏期準確確定病害的發生程度，以便做好防治措施，從而減輕危害，提高經濟效益。潘娟娟等［6］運用實時熒光定量PCR對小麥條銹菌Puccinia striiformis進行了檢測，其檢測效果令人滿意。本研究擬建立的實時熒光定量PCR檢測方法能夠用于監測山核桃樹體內潛伏侵染期內的含菌量，對于做好早期預防，指導病害的適時防治具有重要意義。

1　材料與方法

1.1供試菌株

所用菌系為山核桃干腐病菌，均于2014年8月4日采集自浙江省臨安市湍口鎮的山核桃林，并經過多次培養、純化得到。

1.2山核桃干腐病病菌DNA與無病山核桃植株及所有微生物總基因組DNA的提取

使用生工生物工程（上海）有限公司生產的真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取干腐病菌DNA（提取方法參照試劑盒使用說明書），并使用該公司生產的Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（植物）提取無病山核桃植株及所有微生物總基因組DNA（提取方法參照試劑盒使用說明書）。其中提取無病山核桃植株及所有微生物總基因組DNA時，所有樣品均隨機取于5～10年生的山核桃植株主干未發病處樹皮，具體見1.7。所有DNA樣品置于-20℃保存備用。

1.3山核桃干腐病病菌特異性引物的設計

參考葡萄座腔菌EF1α（GenBank：HM176506.1，elongation factor 1 alpha（EF））基因的序列，使用Beacon Designer7軟件各設計山核桃干腐病病菌特異性引物：EFRT-F1（5′＞TTTGCCTTATCACTCTCT＜3′）和EFRT-R1（5′＞TACTTGAAGGAACCCTTG＜3′），引物由杭州擎科梓熙生物技術有限公司合成。設計的引物能夠精確區分葡萄座腔菌與引起山核桃病害的其他病原物。

1.4引物特異性檢測

應用特異性引物對山核桃干腐病菌DNA和無病山核桃植株及所有微生物總基因組DNA進行普通PCR擴增和實時熒光定量PCR擴增，測定引物特異性。

普通PCR反應體系為：25.0 μL，其中2×PCR緩沖液12.5 μL（生工生物），上述合成的引物各1.0 μL，滅菌蒸餾水10.0 μL，模板0.5 μL。反應程序為：95℃5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s；30個循環；72℃延伸5 min。PCR產物經質量濃度為1.5%瓊脂糖凝膠電泳（140 V，14 min），經過嗅化乙錠（EB）染色后，用天能2200凝膠成像系統成像。

實時熒光定量PCR反應體系為：25.0 μL，其中，SYBR 12.5 μL（TAKARA，Premix EX TaqTMⅡ），引物各1.0 μL，模板為2.0 μL，滅菌蒸餾水8.5 μL。反應程序為：95℃5 min；95℃5 s，56℃30 s，72℃25 s；40個循環；65℃延伸5 s。通過溶解曲線判斷是否有唯一的產物峰。

1.5引物靈敏度檢測

將制備的山核桃干腐病菌DNA稀釋為100 000.0，10 000.0，1 000.0，100.0，10.0，1.0，0.1 μg·L-1等不同的質量濃度梯度，用該引物進行普通PCR擴增與實時熒光定量PCR擴增，測定該引物的靈敏度（反應體系和條件同1.4所述）。

1.6特異性引物的實時熒光定量PCR標準曲線的繪制

將山核桃干腐病菌DNA用EASY Dilution（TAKARA）定量后梯度稀釋（同1.5所述），用特異性引物使用CFX96TMreal-time PCR Detection System（Bio-Rad）進行實時熒光定量PCR擴增，重復3次，用Excel軟件生成標準曲線。

1.7實時熒光定量PCR定量檢測山核桃樣品中的病原菌含量

于2014年10月6日正浙江省臨安市湍口鎮采集山核桃樣品6份，其中發病部位樣品3份，無病健康樣品3份，提取總基因組DNA（總量為100.0 μL），進行實時熒光定量PCR檢測其中山核桃干腐病病菌的含量。DNA提取方法參照Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（植物）說明書。

2　結果與分析

2.1山核桃干腐病病菌特異性引物的測定

應用引物EFRT-F1/R1分別以山核桃干腐病病菌DNA和無病山核桃植株及所有病原物總DNA為模板進行PCR擴增，結果表明：應用該引物能夠擴增出以山核桃干腐病病菌DNA為模板的目標條帶，而以山核桃健康無病植株及所有微生物總基因組DNA為模板的均未擴增出目標條帶（圖1）。實時熒光定量PCR擴增結果同樣表明：該對引物對山核桃干腐病菌只有唯一的產物吸收峰（圖2）。因此該引物相對于山核桃干腐病病菌具有特異性，可用于后續試驗。

圖1　引物EFRT-F1/R1對山核桃干腐病病菌的特異性電泳圖譜Figure 1 Specificity of the selected primer pair EFRT-F1/R1 to Botryosphaeria dothidea

圖2　應用引物EFRT-F1/R1對山核桃干腐病病菌實時熒光定量PCR擴增的溶解曲線Figure 2　Melting curves of real-time PCR amplification of Botryosphaeria dothidea based on primer pair EFRT-F1/R1

2.2引物在常規PCR及實時熒光定量PCR下的靈敏度測定

利用梯度稀釋的山核桃干腐病病菌DNA對特異性引物分別做普通PCR與實時熒光定量PCR的靈敏度測定。普通PCR電泳結果顯示到第2條，所對應的模板濃度為10 000.0 μg·L-1，表明在普通PCR條件下，應用該引物最低可以檢測到10 000.0 μg·L-1的病原菌DNA量（圖3）。在實時熒光定量PCR條件下，應用該引物對不同濃度梯度的模板DNA進行檢測，重復3次，發現第1～4條的cq值呈線性關系，所對應的模板DNA質量濃度分別為100 000.0，10 000.0，1 000.0，100.0 μg·L-1，自第5條起無線性關系，因此可確定在普通實時熒光定量PCR條件下，應用該引物最低可以檢測到100.0 μg·L-1的病原菌DNA（圖4）。運用實時熒光定量PCR的檢測靈敏度是普通PCR的100倍。

2.3實時熒光定量PCR定量檢測山核桃樣品中的菌量

2.3.1標準曲線將山核桃干腐病病菌DNA用EASY Dilution梯度稀釋后（同1.5所述），用引物EFRTF1/R1擴增建立標準曲線（圖5）。線性方程為y=-3.262 0x+27.106（R2=0.997 0），其中y為cq值，x為山核桃干腐病菌DNA質量濃度常用對數（lg）值。

2.3.2山核桃樣品中病原菌的實時熒光定量PCR定量測定應用特異性引物EFRT-F1/R1以1.7的樣品DNA為模板進行實時熒光定量PCR檢測，結果顯示：樣品1，樣品2和樣品3的山核桃干腐病病菌含量是可以檢測出的，由回歸曲線可算得，樣品1中病菌質量分數為2 493.5 ng·g-1，樣品2中病菌質量分數為587.2 ng·g-1，樣品1中病菌質量分數為744.1 ng·g-1。

圖3　運用普通PCR探測引物EFRT-F1/R1的靈敏度Figure 3　Sensitivity of PCR detection using primer pairEFRT-F1/R1

圖4　運用實時熒光定量PCR探測引物EFRT-F1/R1的靈敏度Figure 4 Sensitivity of real-time PCR detection using primer pair EFRT-F1/R1

圖5　質量濃度從100.0～100 000.0 μg·L-1的10倍稀釋液的回歸曲線Figure 5　Standard curve developed by using 10-fold dilutionsof DNA of 100.0-100 000.0 μg·L-1

3　討論

圖6　運用實時熒光定量PCR檢測樣品的cq值Figure 6 Detection of sample cqby using real-time PCR

INDERBITZIN等［7］對常見的葡萄座腔菌科7種病原真菌進行了研究，比較了ITS，EF1α，GPD，His，Hsp，Tublin，Combened基因片段的可變序列。結果表明：它們的EF1α基因片段的可變序列的比例相對較高。EF1α是葡萄座腔菌屬真菌常見的保守基因，由于該基因片段在同屬真菌中可變序列比例相對較高，因此同屬不同種的真菌的EF1α基因片段差異較大，根據EF1α基因設計的引物更具特異性。本研究以此為參照，根據EF1α基因設計出特異性引物。山核桃主要病害有干腐病、枝枯病、膏藥病等，本研究所設計的引物可以擴增出山核桃干腐病病菌的目的基因片段，以區別其他病原物。

目前，實時熒光定量PCR技術已經非常成熟，能夠有效地應用于病原菌等微生物的檢測，并且靈敏度非常高［8］。應用實時熒光定量PCR對小麥條銹病病菌DNA進行定量檢測，其靈敏度約為100.0 ng· L-1，比普通PCR高出100倍［6］。本研究對比了普通PCR和實時熒光定量PCR的擴增結果可得后者的擴增靈敏度比普通PCR高100倍。普通PCR在電泳過程中受外界干擾較大，進而導致低的擴增產物在凝膠成像儀中無法成像，靈敏度相對較低。

山核桃干腐病是山核桃生產中重要的病害，具有明顯的潛伏侵染特性。因此，山核桃干腐病的早期監測和病菌的定量分析具有重要意義。本研究運用上述建立的方法對多個山核桃樣品進行檢測，再通過標準曲線的線性回歸方程可以準確計算出這些樣品中的病原菌含量，并且，制定出了山核桃干腐病的經濟閾值，對農業生產和化學農藥合理使用的意義也十分重大。

4　參考文獻

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Quantifying Botryosphaeria dothidea infection causing canker disease on Carya cathayensis using real-time PCR

ZHU Zhixiang, SHI Haojie, LEI Feibin, ZHANG Chuanqing
（School of Agricultural and Food Science, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, Zhejiang, China）

Abstract:Canker disease caused by Botryosphaeria dothidea is the most important disease that threaten the production of Chinese hickory and has the significant characteristics of“latent infection”.Therefore, the development of a quantitative detection technique of B.dothidea in hickory plants is the prerequisite for its forecasting and scientific management.In this study, specific primers were respectively designed based on the conserved regions of EF1α gene of B.dothiaea.Results of both real-time PCR and common PCR showed that the specificity and sensitivity of EFRT-F1/R1 was good primer pair.A band of 230 bp could be stably amplified by

the primers EFRT-F1/R1.Further study displayed that this real-time PCR technique is more sensitive（more than 100 fold）than the common one.Our molecular detection technique will provide scientific basis for fore

cast, and management of hickory canker disease.［Ch, 6 fig.8 ref.］

Key words:forest protection; comker disease; real-time PCR; specific primers; genome DNA

作者簡介：朱致翔，從事植物病害治理研究。E-mail：zhuzhixiang@189.cn。通信作者：張傳清，教授，從事殺菌劑與植物病害治理研究。E-mail：cqzhang@zafu.edu.cn

基金項目：國家林業局公益性行業科研專項（201304403）

收稿日期：2015-04-03；修回日期：2015-05-31

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.02.024

中圖分類號：S718.83

文獻標志碼：A

文章編號：2095-0756（2016）02-0364-05