新型硅基固載材料的制備及固定化酶性能

傅小萍，姚珊珊，王　瑩，郭　明（浙江農林大學理學院，浙江臨安311300）

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新型硅基固載材料的制備及固定化酶性能

傅小萍，姚珊珊，王瑩，郭明
（浙江農林大學理學院，浙江臨安311300）

摘要：利用溶膠-凝膠原理，以正硅酸乙酯（TEOS）為原料，3-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（KH-560）為偶聯劑，在酸性條件下發生縮合反應制備新型基質材料，通過紅外光譜（FT-IR），固體核磁共振波譜（CP/MAS(13)C NMR）和X-射線衍射（XRD）對基質載體進行結構表征。通過交聯-包埋固定化法制備新型纖維素固載酶，分析研究了固載酶及游離酶酶解不同微觀尺度纖維素基質的酶學性能。結果表明：固載酶進行酶促反應的最優pH 4.0，最優溫度為60℃，表明固載酶的熱穩定性優于游離酶；測得固載酶的米氏常數與游離酶無顯著差異；固定化纖維素酶的重復使用性和儲存穩定性較游離酶均有較大改善。有關研究可為制備性能優良的固載酶提供一定借鑒。圖9表2參20

關鍵詞：纖維素酶；交聯-包埋；固定化；催化性能

酶是一類具有高效催化能力的生物活性物質，生命活動中許多復雜而有規律的物質和能量變化均離不開酶的催化作用。其中，纖維素酶是一類能夠將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，現已確定的主要組分為內切型葡聚糖苷酶、外切型葡萄糖苷酶和纖維二糖酶，它們協同作用，最終水解產物為葡萄糖。纖維素酶主要來源于細菌和放線菌等微生物，原生動物、軟體動物，昆蟲和植物的一些組織也能產生纖維素酶［1］。纖維素類物質是地球上產量巨大卻又未得到充分利用的可再生資源。地球上植物光合作用可產生大于100億t·a-1的植物干物質，其中一半以上是纖維素和半纖維素，合理利用纖維素可為社會的可持續發展做出貢獻［2］。由于纖維素的充分利用與纖維素酶息息相關，使纖維素酶在生活中的許多領域都有廣泛的應用，如織物整理［3］、蔬菜汁加工［4］、廢紙脫墨［5］等，可創造巨大的經濟效益和社會效益，但游離纖維素酶不易與底物分離，存在重復利用性和儲藏穩定性差等缺點，大大增加了生產成本，因此，采用新技術新方法對纖維素酶進行改性十分重要。其中人們為了提高纖維素酶的重復利用性和儲藏穩定性，常常制成各種固定化纖維素酶。酶的固定化是用物理或化學方法處理水溶性酶，使之不溶于水或固定于固相載體的一種技術，極大地拓寬了酶的應用范圍，成為當前研究的熱點領域。固載材料的制備是獲得性能優越的固載酶的一個關鍵步驟。為了克服酶對熱、酸、堿等因素的不穩定性，提高酶的催化活性，人們對酶的固定化進行了廣泛深入的研究，制備出許多新的固定化材料［6-8］。相比較而言，無機載體比有機載體更耐生物降解，有更高的熱穩定性且價格更低。本工作在前人研究的基礎上，分析比較現有固載材料和方法［9-10］，通過正硅酸乙酯（TEOS）的酸性水解產物和偶聯劑3-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（KH-560）的縮合反應合成新型基質載體，并用紅外光譜分析固體核磁譜（13C NMR）分析和X-射線衍射分析對基質載體進行結構表征；通過交聯-包埋方法［11-12］制備新型纖維素固載酶，測定固載酶不同微觀尺度纖維素基質的酶學性能。實驗結果表明，所制備的纖維素固載酶除保持了酶的高效、專一、溫和及活性可調控等催化特性外，熱穩定性也有較大幅度提高，并且具有易分離回收、可重復使用、儲存穩定性好等諸多優點，對實現纖維素酶的高效利用具有較好的借鑒意義。

1　實驗部分

1.1試劑與儀器

正硅酸乙酯（CP化學純，≥28.0%，江蘇強盛功能化學股份有限公司）；乙醇（AR分析純，≥99.7%，國藥集團化學試劑有限公司）；乙酸（AR分析純，≥99.5%，永華化學科技有限公司）；3-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（97.0%，上海晶純生化科技股份有限公司）；羧甲基纖維素鈉（CP化學純，國藥集團化學試劑有限公司）；納米纖維素溶液（濕）質量分數為0.6 %，實驗室自制）；纖維素酶（16.67×10-5kat· g-1，上海晶純生化科技股份有限公司）；3,5-二硝基水楊酸（CP化學純，≥98.0%，國藥集團化學試劑有限公司）；氫氧化鈉（AR分析純，≥96.0%，西隴化工股份有限公司）；酒石酸鉀鈉（AR分析純，≥99.0%，天津市永大化學試劑有限公司）；苯酚（AR分析純，天津市永大化學試劑有限公司）；無水硫酸鈉（AR分析純，99.0%，浙江三鷹化學試劑有限公司）；實驗用水為雙蒸水。集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S型，中國鞏義市予華儀器有限責任公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9123A型，中國上海一恒科學儀器有限公司）；循環水式多用真空泵（SHZ-C型，中國鞏義市予華儀器有限責任公司）；Zeta電位及粒度分析儀（90Plus Zeta型，美國Brookhaven公司）；傅里葉變換紅外光譜儀（IR Prestige-21型，日本Shimadzu公司）；X-射線衍射儀（XRD-6000型，日本Shimadzu公司）；核磁共振波譜儀（AVANCE II 400MHz型，瑞士Bruker公司）；紫外可見分光光度計（T6系列型，中國北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.2硅基質載體材料的合成［13-15］

25.0mL正硅酸乙酯（TEOS）溶解在50.0 mL乙醇中，40℃恒溫加熱攪拌5 min，加入50.0 mL水繼續攪拌10 min，加入乙酸調節酸堿度至pH 2～3，升溫至80℃，攪拌1 h；加入5.0 mL偶聯劑3-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（KH-560），攪拌4 h；烘箱100℃烘15 h至干燥；用水淋洗基質載體數次，再用乙醇淋洗數次，然后烘箱70℃烘4 h至完全干燥，得到白色固體顆粒，再用研缽研磨，得到白色粉末狀環氧化二氧化硅基質載體。基質載體合成的方程式如下：

以乙醇為溶劑，在乙酸催化作用下，使正硅酸乙酯（TEOS）水解，得到水解產物。

以KH-560為偶聯劑，與前述步驟中得到的水解產物進行縮合反應，制備含高活性基團的環氧化二氧化硅基質載體，該基質載體為穩定固體狀凝膠。

1.3環氧化二氧化硅基質載體的結構表征

紅外光譜（FT-IR）分析：采用傅里葉變換紅外光譜儀，溴化鉀（KBr）壓片制樣，掃描波數范圍為4 000～500 cm-1。

13C NMR固體核磁譜分析：采用核磁共振波譜儀測定產物的固體核磁CP/MAS13C NMR譜，觀測頻率75.0 MHz，魔角自旋速度3.8 MHz，分辨率4.88 Hz；內參考物：氨基乙酸。

X-射線衍射分析：采用X-射線衍射儀分析樣品結晶度。掃描方式：定性，步進掃描；掃描速度：10°·min-1；掃描范圍為2θ：10°～50°；步長：0.02°；電壓/電流：35 kV/30 mA；Cu2+靶。

1.4纖維素固載酶的制備

準確稱取1.5 g環氧化二氧化硅基質載體，加入25.0 mL pH 5.0的1.0 g·L-1纖維素酶的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，室溫下浸漬2 h，過濾，獲得固載酶，用pH 5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液淋洗固載酶數次，除去固載酶表面的游離酶。

固定化酶制備過程如下：

高溫烘干凝膠并淋洗，再次烘干研磨后為白色粉末狀。取基質載體與纖維素酶溶液反應，環氧化二氧化硅基質載體上的環氧基與纖維素酶上的氨基發生共價鍵聯，實現纖維素酶的固定。

1.5納米纖維溶液制備

根據文獻［16］，按照m（納米纖維）∶m（溶劑）=1∶50，將納米纖維溶解在9.0 moL·L-1的硫氰酸鋰（LiSCN）溶液中，攪拌溶解過濾，去離子水透析3 d后，再將所得溶液配制成質量分數為0.6%的納米纖維溶液。

1.6納米纖維溶液表征

Zeta電位和粒度分析，Zeta電位是表征顆粒分散系穩定性的重要指標［17］，因此，納米纖維溶液的Zeta電位也是表征納米纖維能否在溶液中穩定存在及粒徑大小的重要指標。將所得質量分數為0.6%納米纖維溶液配成0.06 g·mL-1水溶液，采用90 Plus Zeta型Zeta電位及粒度分析儀測試樣品的粒徑及Zeta電位。

1.7酶學性能測定

1.7.1 pH值和溫度對纖維素酶活性的影響取0.5 g固載酶和游離酶在40℃，pH 3.0～8.0條件下，分別與2.0 mL 6.0 g·L-1的羧甲基纖維素鈉（CMC）溶液和納米纖維素（NCC）溶液進行酶促反應，反應20 min，采用濾紙酶活（FPA）測定酶活［18］，考察pH值對酶活性的影響。將固載酶和游離酶在40～80℃溫度范圍內和pH 5.0條件下，分別與2.0 mL 6.0 g·L-1CMC溶液和NCC溶液進行酶促反應，反應20 min，測定酶活，考察溫度對酶活性的影響。

1.7.2纖維素酶的重復利用性和儲藏穩定性的測定將纖維素固載酶和纖維素游離酶分別與2.0 mL 6.0 g·L-1CMC溶液和NCC溶液在40℃，pH 5.0的條件下，反應20 min，重復反應6次，測定酶活，考察酶的重復利用性。將纖維素固載酶和纖維素游離酶儲存在4℃冰箱內，隔7 d取定量0.5 g的固定化酶和游離酶在40℃，pH 5.0條件下，分別與2.0 mL 6.0 g·L-1羧甲基纖維素鈉（CMC）溶液和納米纖維素（NCC）進行酶促反應，測定酶活，考察酶的儲藏穩定性。

1.7.3纖維素酶的米氏常數的測定將固載酶與纖維素游離酶分別與1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 g·L-1的CMC溶液和NCC溶液進行反應，20 min后，分別在之后的第2，5，8，11，14，17，20 min條件下測定酶活，以反應速率的倒數對底物濃度的倒數作圖，經線性擬合得出米氏方程和米氏常數Km值［19］。

2　實驗結果與討論

2.1新型固載材料的表征

基質載體的紅外光譜（FT-IR）分析結果如圖1所示。由圖1可見：中間產物二氧化硅和基質載體在3 650 cm-1處都有—OH的特征吸收峰；在1 110和1 100 cm-1處出現的特征吸收峰較寬，是由Si—O和C—O鍵特征吸收峰的重疊造成的；在798和800 cm-1處為環氧基的特征吸收峰；在2 940 cm-1處，中間產物無—CH2—的特征吸收峰，基質載體有該特征吸收峰，說明中間產物二氧化硅和偶聯劑KH-560實現了共價鍵聯，從對IR的分析，可以初步判斷基質載體合成成功。

圖1　中間產物二氧化硅和基質載體的IR譜Figure 1 IR spectra of the intermediate and the carrier

基質載體的13C NMR固體核磁譜分析結果如圖2所示。由圖2可知：在0～50 mg·L-1間存在強度約為1∶2∶1的13C信號峰，說明合成的基質載體含有R—CH2—R結構，在50～80 mg·L-1存在13C信號峰，說明了基質載體中C—O的存在，與目標基質載體環氧化二氧化硅結構相符，說明基質載體合成成功。

圖2　基質載體的CP/MAS13CNMR譜Figure 2 CP /MAS13C-NMR spectroscopy of intermediates and the carrier

基質載體的X-射線衍射（XRD）分析結果如圖3所示。

圖3　中間產物及基質載體的X-射線衍射圖譜Figure 3　X-ray diffraction spectra of intermediates and the carrier

由圖3數據，結晶度按式（1）計算，數據列于表1。

表1　基質載體的結晶度Table 1　Degree of crystallinity of intermediate and the carrier

式（1）中：Xc為結晶度，Sc為X-射線衍射圖譜中結晶區部分面積，k為校正因子，Sa為X-射線衍射圖譜中非結晶區部分面積。

由圖3可知：縮合反應前后峰的形狀沒有發生太大變化，中間產物的結晶度為46.30%，基質載體的結晶度43.54%，僅略有減小，說明偶聯劑KH-560的加入對中間產物二氧化硅試樣的結構并無太大影響。綜合分析表明，成功合成獲得了新型硅基載體材料。

2.2固載酶及游離酶酶解不同微觀尺度下的纖維素基質性能

2.2.1自制納米纖維粒徑的測定自制納米纖維素粒子數量與粒徑的分布關系如圖4所示。由圖4可知：納米纖維素的粒徑分布在105 nm取得最大值，納米纖維素的平均粒徑接近納米尺寸，粒徑較小。

2.2.2 Zeta電位的測定一般文獻認為［20］，對于非納米粒子，Zeta電位絕對值在30 mV以上的穩定性較好，但是由于納米粒子的粒徑較小，單個粒子表面提供電荷的官能團的數量較少，可能會引起所測得的Zeta電位絕對值偏低。本工作由Zeta電位儀測得所制備的納米纖維素的Zeta電位為-29.72 mV，可認為穩定性較好。

圖4　數量-粒徑分布關系圖Figure 4 Graph of relationship between number and the particle size distribution

2.2.3固定化酶最適pH值的范圍將纖維素固載酶和游離酶在pH 3.0～8.0的范圍內與分別與CMC溶液和NCC溶液反應，測定固載酶和游離酶的活性，結果見圖5。由圖5可知：無論底物是CMC溶液，還是NCC溶液，固載酶的最適pH值都為pH 4.0，游離酶的最適pH值都為pH 5.0。CMC與2種形態酶的反應程度都較NCC高，可能原因為自制納米纖維溶液溶質粒徑雖達到納米級要求，但是顆粒大小不均勻，因此，底物為CMC時的酶促反應效果較底物為NCC時好。

圖5　pH對酶活性的影響Figure 5　Effect of pH value on the enzymatic activity

2.2.4固定化酶最適溫度的范圍將纖維素固載酶和游離酶在40～80℃的范圍內和pH 5.0的條件下，分別與CMC溶液和NCC溶液反應，測定固載酶和游離酶的活性，結果如圖6所示。由圖6可知：無論底物是CMC溶液，還是NCC溶液，固載酶的最適溫度都為60℃，游離酶的最適溫度都為50℃，說明固載酶較游離酶有更好的熱穩定性。這是因為纖維素固載酶的接枝長鏈對纖維素酶具有一定的包埋作用，使固載酶的剛性增加，必須升高溫度增加柔性，才能和底物分子結合。

圖6　溫度對酶活性的影響Figure 6　Effect of tempertature on the enzymatic activity

2.2.5固定化酶的重復使用性將固載酶和游離酶在pH 5.0和40℃條件下與CMC溶液與NCC溶液反應，測定固載酶和游離酶的活性。重新裝入底物溶液，再次反應后測定酶活性，如此反復操作6次，結果見圖7。由圖7可知：經過6次反應后，固載酶對于底物CMC溶液的酶活性高于NCC溶液，表明固載酶對于CMC溶液有更好的重復利用性。酶活性逐步下降的可能原因為底物逐步進入基質載體的孔道，與固載酶發生作用或部分以游離形態被束縛在基質載體中的酶隨反應進行逐步與基質載體脫離從而與底物發生作用，使得酶不斷被消耗數量減少，表現為活性降低。

圖7　酶的重復利用性Figure 7 Reusability of cellulase

2.2.6纖維素酶的儲藏穩定性將固載酶和游離酶儲存于4℃的冰箱內，隔7 d，測定1次酶活，連測28 d，結果見圖8。由圖8可知：28 d后，無論底物是CMC溶液，還是NCC溶液，固載酶的酶活性都高于游離酶，說明固載酶較游離酶有更好的儲藏穩定性。這是因為酶與基質載體結合生成固載酶以后結構更加穩定，抵抗外界環境對酶活的影響。

圖8　酶的儲藏穩定性Figure 8　Storage stability of cellulase

2.2.7纖維素酶米氏常數的測定在溫度、pH值及酶濃度恒定的條件下，底物濃度對酶促反應速度有很大的影響。底物濃度很低時，酶促反應的速度隨底物濃度的增加迅速增加，隨反應底物濃度繼續增加，反應速度的增加開始減慢，當底物濃度增加到一定值時，反應速度達到最大極限。底物濃度［S］與酶反應速率v間的定量關系由米氏方程給出：

用酶反應速率的倒數對底物濃度的倒數作圖，經線性擬合，結果列于圖9和表2。結果表明：固載酶與CMC溶液和NCC溶液作用的米氏常數分別為1.58 g·L-1和2.36 g·L-1；游離酶與CMC溶液和NCC溶液作用的米氏常數分別為1.40 g·L-1和2.12 g·L-1，表明固載酶與底物的親和力較游離酶有所減小，可能原

圖9　Lieweaver-Burk曲線Figure 9 Lieweaver-Burk curves

式（2）中：v為反應初速率，V為最大反應速率，［S］為底物濃度，Km為米氏常數，Km值等于酶促反應速度達到最大反應速度一半時所對應的底物濃度。Km是酶的特性常數之一，它包含著酶與底物結合和解離的性質，不同的酶Km值不同，同一種酶與不同底物反應Km值也不同。Km值可近似地反映酶與底物的親和力大小：Km值大，表明親和力小；Km值小，表明親和力大。米氏方程兩邊同時取倒數，得到：因為固載酶由于基質載體的阻礙作用，減少了酶與底物的接觸面積，使得相較游離酶親和力有所減小。2種形態的纖維素酶對CMC的親和力比對NCC的親和力強，可能原因為自制納米纖維溶液溶質粒徑雖達到納米級要求，但由于NCC顆粒大小的不均勻性，使得較底物為CMC時酶促效果稍差，表現為親和力有所減小。

表2　游離酶與固定化酶的米氏常數Table 2 Kmvalue of free and immobilized cellulose

3　結論

自制纖維素溶液的粒徑分布在105 nm左右，接近納米纖維素級別；Zeta電位為-29.72 mV，說明納米纖維素溶液穩定性較好。將所制備的纖維素固載酶的酶學性能與纖維素游離酶相比較的結果表明：無論底物是羧甲基纖維素鈉，還是納米纖維素，此固載酶進行酶促反應的最優pH值都為pH 4.0左右，最優溫度都為60℃，比游離酶提高10℃，表明固載酶的熱穩定性優于游離酶。此外，固載酶的重復利用性和儲藏穩定性與游離酶相比都有較大的提高。測得固載酶的米氏常數比游離酶稍大，表明其與底物的親和力與游離酶相比有所減小。

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Preparation and performance of novel immobilized cellulase

FU Xiaoping, YAO Shanshan, WANG Ying, GUO Ming
（School of Sciences, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, Zhejiang, China）

Abstract:A novel carrier was synthesized by condensation reaction with an acid catalytic action using tetraethyl orthosilicate and KH-560 as the silica resource and coupling reagent, respectively.The composition and structure of the carrier were characterized by infrared absorption spectroscopy,(13)C nuclear magnetic resonance, and X-ray diffractometry.The novel immobilized cellulase was prepared by the crosslinking-embedding immobilized method.The enzymatic characteristics of the immobilized cellulase were tested and compared with that of free cellulase.Experimental results showed that the immobilized cellulase maintained higher activity in the broader ranges of pH and temperature.The Michaelis constant（Km）of immobilized cellulase（1.58 g·L(-1)）is similar as the free cellulase（1.40 g·L(-1)）.Thus, immobilized cellulase could have a stronger affinity, reusability, and storage stability; and could provide a reference for preparing immobilized enzymes to perform better.［Ch, 9 fig.2 tab.20 ref.］

Key words:cellulase; crosslinking and embedding; immobilized; catalytic property

作者簡介：傅小萍，從事生物質材料研究。E-mail：1940468653@qq.com。通信作者：郭明，教授，博士，從事生物質材料研究。E-mail：guoming@zafu.edu.cn

基金項目：浙江省大學生科技創新活動計劃暨新苗人才計劃資助項目（2014R412026, 201111030107）

收稿日期：2014-04-20；修回日期：2015-06-29

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.02.018

中圖分類號：TQ352.2；S7-05

文獻標志碼：A

文章編號：2095-0756（2016）02-0315-07