國槐槐角種胚細胞懸浮培養的動力學研究

陳紅賢，于笑笑，王晨陽，張　敏，劉忠華（北京林業大學生物科學與技術學院，北京100083）

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國槐槐角種胚細胞懸浮培養的動力學研究

陳紅賢，于笑笑，王晨陽，張敏，劉忠華
（北京林業大學生物科學與技術學院，北京100083）

摘要：對國槐Sophora japonica槐角種胚細胞懸浮培養的動力學進行研究，在優化細胞接種量的基礎上，分析測定培養周期內不同培養階段的槐角細胞生長和培養基中碳源、氮源、磷源的消耗，以及細胞的鮮質量、干質量和黃酮產量的變化，從而了解細胞生長、營養消耗與次生代謝產物積累的基本規律，為建立結構化動力學模型奠定基礎。結果表明：①初始接種量為40.000 g·L(-1)時，最利于細胞的培養；②細胞的培養周期約為27 d，經過27 d的培養，生物量和黃酮的產量達到最高，分別為9.733 g·L(-1)和53.566 mg·L(-1)，對細胞比生長速率和黃酮比合成速率進行分析，得出黃酮的積累和細胞的生長為部分生長偶聯型，在6～12 d呈負相關，12～33 d呈正相關；③基質中的碳源、氮源、磷源都是在0～6 d被迅速消耗，到12 d時消耗量達到總量的80.00%以上。在氮源的吸收上，銨態氮（NH4+）先于硝態氮（NO3-）的吸收。碳源、氮源、磷源的消耗與細胞生長和產物的積累密切相關。圖10參25

關鍵詞：植物學；國槐槐角種胚；懸浮細胞；黃酮；動力學；基質營養物質

國槐Sophora japonica屬于豆科Leguminosae槐屬Sophora植物，主要分布在中國北部。其果實即槐角，槐角中含有大量黃酮類物質，黃酮類化合物是一類在自然界廣泛分布的多酚類物質，又稱為黃酮體、黃堿素和類黃酮［1］。研究表明［2-3］，黃酮類化合物具有清除自由基、抗氧化、抗突變、抗癌抗腫瘤、抗衰老、抗疲勞、抗菌抑菌和調節免疫、防治血管硬化、降血糖降血脂血清膽固醇等功能。另外，隨著食品工業的發展與消費觀念的改變，天然活性成分的保健食品成為現代人追逐的目標，其中黃酮類化合物以純天然、高活性、見效快、作用廣泛等特點日益受到人們的關注［4］。目前，關于大豆異黃酮的研究報道較多，其相關食品和保健品也逐步投入市場，但其提取受大豆油脂和蛋白質的影響，工藝復雜，成本偏高；另一方面，槐角中富含黃酮類化合物，其質量分數大于200 g·kg-1［5］，遠遠高于大豆中黃酮化合物的質量分數（約為525～986 mg·kg-1［6］），因此，用槐角代替大豆來生產黃酮化合物更有價值?；苯屈S酮類化合物主要包括槐角苷、染料木素、染料木苷、槐屬雙苷等［7-8］，而槐角苷是槐角黃酮的主要成分，占總提取物的27.9%和總生藥的2.2%［9］。目前，獲取這些具有極高藥用價值的黃酮產物，通常是從槐角中直接提取，而槐角資源的缺乏限制了黃酮作為新型藥劑的推廣。植物細胞懸浮培養技術因為能在人工條件下合成這些天然產物，解決了資源缺乏這一難題，對大規模商業化生產黃酮化合物具有重大的現實意義。利用該技術從國槐中獲得黃酮化合物的研究國內外文獻報道較少，因此，筆者對國槐的細胞培養技術進行了研究。經過前期的研究，本課題組已經成功誘導出槐角種胚愈傷組織，篩選出最佳固體和液體培養基，獲得了穩定的懸浮細胞系，并檢測出黃酮類化合物可以在愈傷組織中積累［10］。愈傷組織中黃酮的積累與初始接種量、細胞生長、基質中營養物質的含量等因素存在密切關系，解析此關系將為細胞由搖瓶培養放大到生物反應器培養提供重要的技術參數和理論依據。生物反應器培養技術是細胞培養生產次級代謝產物，實現大規模工業化生產的關鍵技術之一［11］，因此，本研究在槐角種胚細胞懸浮培養過程中研究了細胞的生長、黃酮的合成以及主要營養物質的消耗，以便了解細胞在懸浮培養過程中的生長規律及動態變化，為提高黃酮的產量及細胞大規模培養提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

國槐槐角愈傷組織來自國槐種胚的誘導［12］，篩選生長快、分散性好的槐角愈傷組織，將其在B5固體培養基上繼代5次以上，獲得穩定的愈傷組織后將其轉接到B5液體培養基中，在液體培養基中進行懸浮培養。通過不斷選擇獲得分散性較好的細胞懸浮物，繼代6次后轉接到新的培養基中，建立穩定的懸浮細胞系。

1.2培養條件

固體培養基為：B5 + 1.00 mg·L-12,4-D + 0.20 mg·L-16-BA，蔗糖質量分數為30%，瓊脂質量分數為6%，滅菌前pH 6.60；液體培養基為B5 + 2.00 mg·L-12,4-D + 0.50 mg·L-16-BA + 0.05 mg·L-1萘乙酸（NAA），蔗糖質量分數為30%，滅菌前pH 6.17［12-13］。培養基均以121℃高壓滅菌30 min。該懸浮體系在溫度為25℃，轉速為110 r·min-1的搖床上全程暗培養，25 d繼代1次。

1.3不同接種量對懸浮細胞的處理

將獲得的分散性好且同步生長的細胞以20.00，30.00，40.00，50.00，60.00 g·L-1作為初始接種量，接種到裝液量為50.0 mL B5液體培養基的100.0 mL三角瓶中培養，26 d后收獲，以收獲時細胞的鮮質量，干質量和黃酮含量為依據，選擇最佳接種量。

1.4分析測定方法

1.4.1細胞生物量和生長曲線的測定以最佳接種量接種懸浮細胞到含50.0 mL B5液體培養基的100.0 mL三角瓶中，自接種之日起隔3 d測定1次細胞的生物量：取出搖瓶，用紗布過濾2次后收集細胞，濾液保存到干凈的無菌瓶中備用。細胞用去離子水沖洗3次后用濾紙吸干至接種時的狀態，測其鮮質量（g），然后將材料放入烘箱中70℃恒溫烘干10 h至恒量，測其干質量（g），重復3次·測定-1，繪制細胞的生長曲線。

1.4.2黃酮質量分數的測定①標準品的處理。黃酮類化合物質量分數的測定采用紫外分光光度法［12］，槐角苷為標準品，261.5 nm處測定吸光度D（λ），以吸光度為橫坐標，槐角苷濃度為縱坐標繪制標準曲線，標準曲線方程為：y = 8.090 5x + 0.090 5（R2=0.998 9）。②樣品吸光度的測定。將烘干后的愈傷組織研磨，過80目篩，備用。稱取0.10 g粉末，加4.0 mL體積分數為70%乙醇，室溫下超聲提取40 min。提取后離心，取上清液稀釋30倍后測定其在261.5 nm處的吸光度，重復3次·測定-1?？傸S酮的質量分數mg·g-1（x）以槐角苷計，計算公式如下：x = 30cv/1 000w。黃酮的產量（mg·L-1）= 20x×干質量。其中：c為稀釋后的提取液中槐角苷的質量濃度（mg·L-1），v為所提取槐角苷溶液的體積（mL），w為精確稱取的供試材料的質量（g），x為計算出的黃酮的質量分數（mg·g-1）。

1.4.3生長速率和比生長速率的計算生長速率是用來確定培養物或生物生長速度的量度。細胞培養過程中大多數細胞都有指數生長期，在連續培養過程中指數生長期可能變成很長的時期。對于此類細胞培養，可以用生長速率γx=dX/dt≈ΔX/Δt表示單位時間細胞數量的增加；用比生長速率μx=1/X·dX/dt≈1/X·ΔX/Δt表示單位質量的細胞在單位時間內所增加的細胞質量，其中X是細胞量，t是時間。細胞的生長速率可看做是絕對生長速度，比生長速率可看成是相對生長速度。同理，黃酮的合成速率為γp=dp/dt≈Δp/Δt和比合成速率為μp=1/X·dp/dt≈1/X·Δp/Δt，其中X是細胞量，p是黃酮產量，t是時間。細胞懸浮培養過程中產物積累和細胞生長之間的關系可表述為產物比合成速率和細胞比生長速率之間的關系:μp=αμx+β，α為與生長相關的產物生成系數，β為與生長非相關的產物生成系數。

1.4.4基質中營養物質的測定收集搖瓶中的培養液，碳源含量的測定采用蒽酮試劑法測定［14］；硝酸鹽采用水楊酸比色法測定［15］；銨根離子采用水楊酸-次氯酸鹽光度法測定；磷酸根采用鉬藍比色法測定［16］。

2　結果與分析

2.1接種量對槐角細胞培養的影響

2.1.1接種量對細胞生長鮮質量的影響由圖1可知：在一定范圍內，隨著細胞接種量的增加，收獲時細胞的鮮質量逐漸增加，在接種量為40.00，50.00，60.00 g·L-1時，收獲時細胞鮮質量較大，50.00 g·L-1時最大為4.68 g，接種量為60.00 g·L-1時，鮮質量開始下降。對其進行顯著性分析發現接種量為40.00，50.00，60.00 g·L-1時細胞鮮質量顯著大于接種量為20.00，30.00 g·L-1，而40.00，50.00，60.00 g·L-1之間差異并不顯著。但是，細胞鮮質量的增長倍數并沒有隨著接種量的增大而增加，當接種量為40.00 g·L-1時，細胞鮮質量增長倍數達到最大的2.13倍，接種量為50.00 g·L-1時，細胞鮮質量增長倍數也達到1.87倍。而當接種量為60.00 g·L-1時，細胞鮮質量增長倍數反而下降，為1.49倍。為了以較小的接種量獲得較大的生物量，使接種細胞達到最大的利用率，40.00，50.00 g·L-1的接種量為最佳接種量。

圖1　不同接種量對細胞鮮質量的影響Figure 1　Effect of different inoculum size on cell wet weight

2.1.2接種量對細胞生長干質量的影響分析圖2可知：在一定范圍內，隨著細胞接種量的增加，收獲時細胞的干質量逐漸增加，在接種量為60.00 g·L-1時，收獲時細胞干質量達到最大值，為0.28 g。然后，對其干質量進行顯著性分析，發現當接種量為50.00，60.00 g·L-1時，其干質量顯著高于接種量為20.00，30.00 g·L-1；接種量為40.00 g·L-1時，干質量顯著高于接種量為20.00 g·L-1；但是接種量為40.00，50.00，60.00 g·L-1時，其干質量無顯著性差異。綜合考慮，為了使接種細胞達到最大的利用率，40.00，50.00 g·L-1的接種量較好。

圖2　不同接種量對細胞干質量的影響Figure 2　Effect of different inoculum size on cell dry weight

2.1.3接種量對細胞黃酮質量分數的影響由圖3可以知道：接種量不同，最后的黃酮化合物質量分數不同，接種量為30.00 g·L-1時，黃酮化合物質量分數最高，為9.35 mg·g-1。對它進行方差分析得出，接種量為20.00，30.00，40.00 g·L-1時，黃酮化合物質量分數較高，無顯著性差異；而接種量為50.00，60.00 g·L-1時，黃酮質量分數降低，且顯著低于接種量為20.00，30.00，40.00 g·L-1。所以，從黃酮質量分數來說，接種量為20.00，30.00，40.00 g·L-1較好。綜合以上3個方面，選擇接種量為40.00 g·L-1，收獲生物量和黃酮化合物質量分數都較高。

圖3　不同接種量對黃酮質量分數的影響Figure 3　Effect of different inoculum size on flavonoids content

2.2槐角細胞懸浮培養過程中細胞生長和黃酮積累的動力學分析

2.2.1細胞生長曲線和黃酮化合物合成曲線測定細胞的干質量和黃酮的產量，繪制生長和合成曲線，如圖4?；苯羌毎麘腋∨囵B的周期約為27 d，在1個培養周期內細胞分為延滯期、對數生長期、穩定期和衰亡期。0～6 d這一階段，細胞處于延滯期，生長緩慢，原因可能是細胞在繼代過程中轉入新的培養液中時，新培養基中的滲透壓較高，鹽濃度也較高，而懸浮細胞不能迅速適應，所以此時次生代謝產物含量會比較高；6～27 d為細胞快速生長期，細胞生長迅速，27 d細胞干質量達到最大9.733 g·L-1；27 d以后，細胞進入穩定期。穩定期較短，很快進入衰亡期，生物量逐漸下降，細胞開始死亡。在6～27 d這個時期黃酮化合物的產量隨著細胞干質量的增加也不斷升高，27 d達到最大53.566 mg·L-1。

圖4　細胞生長和黃酮化合物合成曲線Figure 4　Growth curves of Sophora japonica embryo callus and flavonoids production

2.2.2細胞比生長速率和黃酮比合成速率國槐槐角細胞懸浮培養過程中生長速率和比生長速率如圖5所示。由圖5可知：在1個培養周期內國槐槐角細胞的生長速率和比生長速率變化趨勢相同，0～6 d細胞的生長速率和比生長速率較低；到對數生長期，生長速率和比生長速率有2個峰值，從第6天開始，生長速率和比生長速率迅速增加，12 d時達到第1個峰值，生長速率和比生長速率分別為0.356 g·L-1· d-1和0.067 d-1，然后在15 d生長速率和比生長速率有所下降，之后又開始逐漸上升，在24 d時上升到第2個高峰，生長速率和比生長速率分別為0.378 g·L-1·d-1和0.044 d-1，之后生長速率和比生長速率則迅速下降。

圖5　細胞生長速率和比生長速率Figure 5　Dynamic changes of cell growth rate and specific growth rate

國槐槐角細胞懸浮培養過程中黃酮的合成速率和比合成速率如圖6所示。分析圖6可知：黃酮化合物的合成速率與比合成速率的變化趨勢與細胞生長規律不完全一致。在細胞生長較快的第6～12天，黃酮合成速率和比合成速率反而呈下降趨勢，可能是因為細胞經過延緩期適應了培養基的環境，次生代謝產物生成減少甚至不合成。在細胞生長最快的第12天黃酮合成速率和比合成速率達到最低點，合成速率和比合成速率為0.358 mg·L-1·d-1和0.067×10-3d-1。而在15 d之后黃酮合成速率和比合成速率和細胞生長規律比較相似，逐漸上升，可能是因為細胞迅速生長，基數增大，次生代謝產物合成逐漸增加，黃酮合成速率和比合成速率也逐漸增大，在24 d達到最高值，分別為1.662 mg·L-1·d-1和0.192×10-3d-1，之后迅速下降。

圖6　黃酮合成速率和比合成速率Figure 6　Dynamic changes of flavonoids synthesis rate and specific synthesis rate

2.2.3細胞生長和黃酮化合物積累的關系由圖5和圖6可知：細胞的比生長速率和黃酮化合物的比合成速率變化規律不完全相同，可以分為2個時期：第1個時期為6～12 d（圖7a），第2個時期為12～33 d

（圖7b）。圖7a表明：在6～12 d黃酮的比合成速率（μp）隨著槐角細胞比生長速率（μx）的增加而減少，在此期間它們之間關系可以用以下公式表示：μp=-10.633 0μx+0.743 5（R2=0.796 9）。從式可知：黃酮的積累和槐角細胞的生長呈負相關。圖7b表明：在12～33 d黃酮的比合成速率（μp）隨著槐角細胞比生長速率（μx）的增加而增加，在此期間它們之間關系可以用以下公式表示：μp=3.032 3μx+0.022 1（R2=0.950 8）。從式可知：黃酮的積累和槐角細胞的生長呈正相關。

圖7　產物比合成速率和細胞比生長速率的關系Figure 7 Relationship between flavonoids specific synthesis rate and cell specific growth rate of Sophora japonica embryo in suspension culture

2.3槐角細胞懸浮培養過程中對營養物質消耗的動態變化

2.3.1碳源的消耗碳源在國槐槐角細胞懸浮培養過程中的動態變化如圖8所示。在0～6 d消耗迅速，6 d時已經消耗了總糖的68.38%，為細胞快速增長做好了準備，12 d時消耗達80.00%，12 d以后糖的消耗量減少，但質量濃度繼續下降，細胞迅速生長。33 d糖的質量濃度為1.803 g·L-1，整個過程共消耗了總糖的93.00%。

2.3.2氮源的消耗槐角細胞懸浮培養液中的硝態氮和銨態氮質量濃度的動態變化如圖9所示。銨態氮和硝態氮的消耗并不同步，在0～6 d銨態氮被迅速利用，6 d已消耗82.37%，而硝態氮消耗量較低，為11.58%。6 d之后銨態氮質量濃度較低時，硝態氮質量濃度迅速下降，12 d時消耗達95.77%，基質中的大部分氮源被消耗，而此時細胞生長速率達到第1個高峰，與氮源的消耗相符合，但是銨態氮的吸收先于硝態氮。12 d之后銨態氮和硝態氮繼續小幅下降，細胞不斷生長?；|中硝態氮和銨態氮分別在18 d和27 d基本消耗殆盡，細胞生長達到最大值。因此，可以推斷，氮素是影響國槐種胚細胞增殖的一個重要原因。

2.3.3磷源的消耗當把細胞接種到新的培養基后（圖10），細胞開始大量吸收磷酸根離子。在遲滯期0～6 d內消耗了80.78%的磷，進入快速生長期以后，6～12 d磷的消耗量還是較大，第12 d磷的消耗量達92.96%，細胞生長速率也達到最大。之后磷消耗量逐漸減少，到24 d時磷已經被消耗殆盡，細胞生長速率開始下降，可見磷源的含量與細胞懸浮培養密切相關。

2.3.4基質中營養物質的消耗與細胞生長、黃酮積累的關系由圖8～10可知：細胞對基質中的碳源、氮源、磷源的消耗過程大體相似。分析細胞培養過程中營養物質的動態變化與細胞生長和黃酮積累的關系發現：0～6 d，細胞迅速吸收營養物質，營養物質消耗量最大，質量濃度迅速下降，但是吸收的營養物質儲存在細胞中為細胞快速生長做準備，所以細胞生長緩慢，同時處于此時期的細胞產生次生代謝產物，所以細胞的比生長速率較低而黃酮的比合成速率較高；6～12 d這些營養物質濃度仍然下降較快，但幅度較前6 d小，到12 d基本消耗量都達到80.00%以上，延滯期營養物質的大量儲存和細胞對基質中營養物質的繼續吸收為細胞生長提供了充足的營養物質，所以6～12 d細胞迅速生長，比生長速率升高，在12 d達到一個高峰，同時由于營養物質充分，足夠滿足細胞快速生長，很少甚至不會產生次生代謝產物，所以6～12 d黃酮的比合成速率下降，在12 d時達到最低點；12～15 d營養物質基本被消耗掉80%，所以細胞對基質營養的吸收量迅速下降，這一變化可能會暫時破壞細胞生長的平衡，進而產生一些次生代謝產物，所以同12 d相比細胞比生長速率有所下降，黃酮比合成速率開始上升；15～24 d在基質營養物質質量濃度較低的情況下細胞主要依靠自身存儲的營養物質來供細胞生長，且自身存儲的物質可以滿足細胞的生長進而逐漸恢復穩定，所以細胞的比生長速率又開始繼續上升，細胞數量迅速增加，但是在滿足細胞生長的基礎上細胞開始對營養物質有所競爭，加上上一階段次生代謝產物的產生會誘導更多的產物合成，所以黃酮的比合成速率也繼續上升，24 d比生長速率和比合成速率同時達到最大，但是其細胞生長速率小于12 d的第1個高峰，可能是因為營養物質不如12 d充分；24 d之后，基質中的營養物質基本被耗盡，細胞中儲存的也被消耗殆盡，營養物質的嚴重缺乏導致了細胞的比生長速率和黃酮的比合成速率迅速下降。

圖8　培養過程中碳源的動態消耗變化Figure 8　Change of sugar contents in the medium during the cell suspension culture cycle

圖9　培養過程中氮源的動態消耗變化Figure 9　Change of nitrogen contents in the medium　during the cell suspension culture cycle

圖10　培養過程中磷源的動態消耗變化Figure 10 Change of phosphate contents in the medium during the cell suspension culture cycle

3　結論與討論

懸浮細胞分裂增殖前需要一個最低的臨界密度，可能是因為：細胞分裂啟動前，需要細胞內一種稱為條件因子的物質達到一定的內源水平［17］。可通過添加條件培養基或者增加細胞接種量來達到這個內源水平。細胞要維持分裂和生長，其內源代謝物質必須達到一定的閥值，在高密度細胞群和培養基營養充足的情況下，易于達到這個閥值［18］。如果接種量太低，則細胞懸浮液質量濃度過低，使得細胞間的物質交換不充分，不利于細胞的生長；細胞懸浮液的質量濃度過高，使得細胞密度過高，單個細胞會因營養吸收不足而死亡，因此，對于細胞的懸浮培養，選擇合適的接種量至關重要［19］。將繼代培養后同步化生長的懸浮細胞以不同接種量接種于新鮮液體培養基中，測定細胞生長和黃酮合成的情況可為大規模細胞培養的研究奠定基礎。本研究得出槐角種胚細胞懸浮培養的最佳接種量為40.00 g·L-1，過低或過高都不利于細胞的生長和次生代謝產物的積累。Sakano［20］等曾報道過低接種量會嚴重抑制細胞的增殖，與本研究結果一致。

槐角細胞懸浮培養的周期約為27 d，在一個培養周期內細胞分為延滯期、快速生長期、穩定期和衰亡期。0～6 d為延滯期，6～27 d為快速生長期，27 d以后，細胞進入穩定期，穩定期較短，此后很快進入衰亡期。經過27 d的培養，生物量和黃酮的產量均達到最高。分析槐角細胞生長與黃酮積累的動力學關系，在6～12 d黃酮的比生成速率（μp）隨著槐角細胞比生長速率（μx）的增加而減少，黃酮的積累和槐角細胞的生長呈負相關；而在12～33 d黃酮的比生成速率（μp）隨著槐角細胞比生長速率（μx）的增加而增加，黃酮的積累和槐角細胞的生長呈正相關。因此，國槐槐角細胞生長和黃酮積累為部分生長偶聯型。

懸浮培養過程中，細胞主要靠基質中的營養物質來滿足自身的生長和產物的合成。其中碳源主要由蔗糖提供，在細胞培養中糖類具有重要作用，既為細胞生長提供能量，也為初級、次級代謝物合成提供碳支架，同時對滲透壓的調節有重要作用［11］；硝態氮和銨態氮是細胞生長代謝的主要氮來源，調節培養基中總氮濃度或改變銨態氮和硝態氮的比例都可顯著影響細胞培養過程中細胞的生長和次生代謝物的合成［21-22］；磷源是植物細胞內重要的營養成分之一，參與核苷酸、脫氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）和蛋白質等的形成，它的消耗量可以從一個側面反映出細胞的生長情況。因此，研究這幾種營養物質在培養過程中的動態消耗有重要意義。在一個培養周期內，分析槐角細胞和黃酮的比生長速率與基質中主要營養成分的變化，對槐角細胞懸浮培養的生長狀況進行較為全面的分析，發現營養成分的消耗與細胞增殖和產物積累的各個階段是吻合的：0～6 d，細胞處在接種初期，而接種的細胞處于繼代培養后期，細胞因營養不足而處于一種“饑餓”狀態，因此，當細胞轉入新的培養基以后，必將通過主動吸收和擴散等途徑快速吸收營養物質［23］，所以這個時期，基質中的營養物質迅速下降；6～24 d，隨著細胞的快速生長和黃酮的積累，基質中的營養物質基本被消耗；24 d之后，基質中營養物質不足，細胞的增殖和黃酮的合成速率也都開始下降。由此可以推斷，培養液中營養成分的不足限制了細胞的細胞增長和產物積累，基質中碳源氮源磷源的含量與細胞增長和產物積累密切相關，而且銨態氮的吸收先于硝態氮。這與前人的研究［24-25］：在植物細胞生產次生代謝物的過程中，細胞對培養液營養成分的消耗動態直接影響細胞的生長和次生代謝物的合成相一致。該結果為進一步提高槐角細胞中黃酮的產量提供了營養成分依據：可以在國槐種胚細胞培養過程中采用分批添加營養成分的方法來提高黃酮的產量，如在細胞培養的12 d添加蔗糖、硝酸鹽，6 d時添加銨鹽和磷酸鹽，以補充培養基中的營養成分，保持黃酮化合物以較高的速率積累。

本研究結果為提高槐角種胚懸浮細胞中黃酮的積累和后續建立結構化動力模型提供了理論依據，同時為細胞由搖瓶培養放大到生物反應器培養提供了技術參數。

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Kinetics of Sophora japonica embryo cells in a suspension culture system

CHEN Hongxian, YU Xiaoxiao, WANG Chenyang, ZHANG Min, LIU Zhonghua
（College of Biological Sciences and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China）

Abstract:Based on the established cell suspension culture system of Sophora japonica embryos, its kinetics was investigated.The suspension cell system of S.japonica embryos influenced by inoculum size was studied with analysis during cell culture of kinetic parameters, such as cell growth; consumption of C, N, and P; as well as changes in cell fresh weight, dry weight, and flavonoid production at various stages in the culture procedure.Results revealed that.（1）the preferable inoculum size for suspension cell proliferation was 40.000 g·L(-1).（2）The cell suspension culture cycle lasted about 27 d with maximum biomass in dry weight reaching 9.733 g·L(-1)and flavonoid production attaining 53.566 mg·L(-1).Flavonoid production was semi-associated with cell growth of the S.japonica embryo being negatively related from 6-12 d and positively related from 12-33 d.（3）From 0-6 d sugar, N, and phosphate were absorbed quickly; after 12 d they were more than 80% absorbed.Also, NH4+was utilized faster than NO3-.Thus, proliferation and flavonoid production of S.japonica embryo cells was closely related to the consumption of sugar, N, and phosphate.This research could provide references for the scale-up culture of S.japonica embryos cell by bioreactor.［Ch, 10 fig.25 ref.］

Key words:botany; Sophora japonica embryo; suspension cell; flavonoids; kinetics; matrix nutrient

作者簡介：陳紅賢，從事藥用植物及其次生代謝研究。E-mail: 965600690@qq.com。通信作者：劉忠華，副教授，博士，從事植物生長發育及系統進化研究。E-mail: liuzh6@bjfu.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金資助項目（J1103516）；北京林業大學理科生物學基地國家自然科學基金子項目（ZD008）

收稿日期：2015-05-11；修回日期：2015-06-15

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.02.012

中圖分類號：S718.3；Q942

文獻標志碼：A

文章編號：2095-0756（2016）02-0272-08