高效毛細管電泳法快速測定乳鐵蛋白原料的純度

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司，呼和浩特011500）

高效毛細管電泳法快速測定乳鐵蛋白原料的純度

劉宇，陳偉，史玉東，李志偉，高增麗，侯慧敏，陳云

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司，呼和浩特011500）

建立了動態(tài)涂層毛細管電泳快速檢測乳鐵蛋白含量的方法。并運用該方法對不同乳鐵蛋白原料的純度進行了檢測。經(jīng)檢測4種乳鐵蛋白原料的純度分別為乳鐵蛋白A91.05%，乳鐵蛋白B93.62%，乳鐵蛋白C94.38%，乳鐵蛋白D75.81%；相對標準偏差（RSD）分別為1.0%，0.8%，1.2%，0.9%。并與供應商所提供的原料純度進行比較，討論了造成二者之間略微差異的原因。結果表明，該動態(tài)涂層方法能夠有效抑制毛細管內(nèi)壁對乳鐵蛋白的吸附，對于乳鐵蛋白的檢測及純度的驗證十分有效，為此類蛋白的檢測提供了一種手段。

高效毛細管電泳；動態(tài)涂層；乳鐵蛋白；純度

0 引 言

牛乳鐵蛋白(Lactoferrin，LF)是一種具有多種生物學功能的非血紅素鐵結合糖蛋白，主要由乳腺上皮細胞表達和分泌[1]。其分子量約為80 ku，等電點為8.0± 0.2，結構與血清轉鐵蛋白、血漿或乳漿中的轉鐵蛋白很相似，但是Lf的鐵親和能力是他們的260倍[2]。乳鐵蛋白具有許多特殊的生理活性，既能參與鐵的轉運，又能調節(jié)免疫系統(tǒng)，同時具有抗菌、抗氧化、抗癌、調節(jié)免疫系統(tǒng)等功能[3]。許多乳制品公司把乳鐵蛋白作為一種重要的功能性原料，添加到嬰幼兒配方奶粉、兒童奶等高附加值的產(chǎn)品中[4，5]。

目前乳鐵蛋白檢測方法有酶聯(lián)免疫法[6]、放射免疫擴散法[7]、表明等離子共振技術[8]、液相色譜法[9]、分光光度法[10]、毛細管電泳法[11]。不同的檢測方法，精確度、檢出限以及成本等條件各有不同。本試驗從實際應用角度出發(fā)，采用動態(tài)涂層法處理石英毛細管柱，為有效防止蛋白質在毛細管內(nèi)壁的吸附，提高檢測準確性、縮短檢測時間，降低檢測成本。

1 實 驗

1.1 儀器及試劑

（1）儀器。P/ACE MDQ型毛細管電泳儀并配有紫外檢測器，Millipore Milli-Elix/RiOs型超純水儀，Z-36HK臺式高速冷凍離心機，VORTEXGEMIE2漩渦混合器，1875D超聲波清洗機，精密pH計，萬分之一天平，未涂層石英毛細管柱（型號為Capillary Tubing-50μm I.D，375μm O.D）。

（2）試劑。氫氧化鈉(分析純)，甲醇（色譜純），三羥甲基氨基甲烷（優(yōu)級純），戊二胺（優(yōu)級純），十六烷基三甲基溴化銨（優(yōu)級純），聚乙二醇（優(yōu)級純），硼酸(優(yōu)級純)，尿素（分析純），羥丙基甲基纖維素（分析純），乙二胺四乙酸二鈉（分析純），乳鐵蛋白標準品（LF≥96%，HPLC）。

（3）乳鐵蛋白原料。乳鐵蛋白A（純度95%），乳鐵蛋白B（純度95%），乳鐵蛋白C（純度95%），乳鐵蛋白D（純度80%）。

1.2 方法

1.2.1 未涂層毛細管的活化

截取內(nèi)徑為50μm，總長度為800 mm（有效長度為700 mm）的未涂層石英毛細管柱，用色譜級甲醇沖洗15 m in，去離子水沖洗15 m in，濃度為1 m oL/L的NaOH沖洗15 m in，靜置20 m in，然后用去離子水沖洗15m in。

1.2.2 未涂層毛細管內(nèi)壁動態(tài)涂層過程

（1）動態(tài)涂層試劑的配制。用去離子水準確配制100 m L動態(tài)涂層試劑，使得各成分濃度為三羥甲基氨基甲烷200 mm ol/L，戊二胺60 mm ol/L，十六烷基溴化銨120 mm ol/L，聚乙二醇80 mm o l/L，用濃度為0.1 m ol/L的N aOH調節(jié)pH值至9.0。

（2）緩沖溶液的配制。用去離子水準確配制100 m L緩沖溶液，使得各成分濃度達到如下：硼酸50 mm ol/L，尿素6 mo l/L，戊二胺60 mmo l/L，十六烷基溴化銨120 mm ol/L，羥丙基甲基纖維素0.05%，用濃度為0.1 m o l/L的NaOH調節(jié)pH值至9.0。

（3）動態(tài)涂層。用濃度為0.1 m ol/L的N aOH沖洗毛細管內(nèi)壁3 m in，去離子水沖洗3 m in，動態(tài)涂層試劑沖洗3 m in，靜置5 m in，緩沖溶液沖洗3 m in，按照以上步驟循環(huán)3次。

1.2.3 標準曲線的繪制及原料的測定

（1）乳鐵蛋白標準溶液的配制。準確稱取10 m g乳鐵蛋白于2m L塑料離心管中，然后加入1m L去離子水，漩渦振蕩至充分溶解，靜置1 h，然后依次梯度稀釋至5，2.5，1.25，0.625 g/L（均為質量濃度）。

（2）檢測設備參數(shù)的確定。檢測器為紫外光檢測器、檢測波長為200 nm，檢測溫度為30℃，進樣方式為壓力進樣，壓力為3.448 kPa，進樣時間為15 s，工作電壓為25 kV，采集頻率為8 H z。

（3）進樣前毛細管的處理。新毛細管首次可直接進樣；下次進樣前，依次分別用濃度為0.1 m o l/L的NaOH、動態(tài)涂層試劑、緩沖溶液清洗3m in后方可進樣。

（4）標準曲線的繪制。將不同濃度的乳鐵蛋白標準溶液依次上樣，得到不同濃度下的峰面積，外標法定量，建立濃度與峰面積之間對應關系的標準曲線。

（5）原料純度的測定。分別準確配制質量濃度為5.0 g/L乳鐵蛋白溶液。在最佳電泳條件下，分別對樣品中進行測定：每個樣品待測液重復進樣5次，計算出峰面積平均值，帶入標準曲線計算得乳鐵蛋白質量濃度。

2 結果與分析

2.1 動態(tài)涂層試劑的選擇

緩沖溶液中加入涂層物質形成動態(tài)涂層時，可用作選擇的涂層物質包括：兩性離子、單胺、低聚胺、表面活性劑、中性的或帶電荷的聚合物[12]。一般地講，這些化合物與毛細管壁之間有強烈的相互作用，因此可以動態(tài)的涂敷在毛細管表面。添加物的性質決定了其與毛細管壁之間的相互作用可以是庫侖引力、氫鍵或者范德華力[13]。毛細管內(nèi)壁經(jīng)氫氧化鈉解離后，呈現(xiàn)帶負電的硅羥基。本文在三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液中加入十六烷基溴化銨，二者直接存在氫鍵，在烷基鏈和硅氧烷基團之間存在疏水性相互作用，因此形成穩(wěn)定的涂層。同時加入戊二胺、聚乙二醇能夠對硅羥基產(chǎn)生靜電吸引從而影響電滲流，改善分離。減少蛋白質在內(nèi)壁的吸附。此外，緩沖溶液中加入羥丙基甲基纖維素也是防止在分離過程中硅羥基內(nèi)壁的解離[14]，其乳鐵蛋白電泳圖譜如圖1所示。

圖1 不同成分動態(tài)涂層試劑乳鐵蛋白電泳圖譜

2.2 緩沖液、pH值的選擇

乳鐵蛋白的分子量為80 ku，等電點為（p I），為堿性蛋白。因此，可以使分離緩沖液的pH值高于其等電點，使其帶負電，與毛細管內(nèi)壁表面一致，從而減少蛋白吸附。由于乳鐵蛋白為糖基化蛋白，易與硼酸根形成帶負電的絡離子，從而進一步增加與毛細管內(nèi)壁的庫倫排斥力，因此分離緩沖體系選用硼酸鹽體系可減少吸附[15]。另外，高濃度硼酸鹽還可提高分離效率，然而，硼酸鹽的濃度過高會產(chǎn)生較多的焦耳熱，引起色譜峰展寬，通過試驗硼酸的最佳濃度為0.5 mol/L。因為硼酸的紫外吸收波長為180 nm，而乳鐵蛋白的吸收波長為200 nm，pKa值是9.24，其緩沖范圍在8.24～10.24之間，試驗發(fā)現(xiàn)隨著pH值的增加，分析物的分離時間延長，分離度增加，但是pH值增加會帶來過高的離子強度，從而使電滲流增加，焦耳熱增多，最后導致峰展寬、靈敏度下降。因此，最終確定最佳pH值為9.0，如圖2所示。

圖2 不同pH值條件下乳鐵蛋白電泳圖譜

2.3 檢測電壓、溫度的選擇

毛細管柱長度確定時，隨著分離電壓的增大，電滲流和電泳遷移速度的絕對值都增大，分離時間縮短，分離效率和分離度增加，但也會產(chǎn)生過量的焦耳熱，如果這些熱量不能及時散失，則縱向溫度梯度增大，從而導致分離效率和分離度下降[16]。因此電泳速度通常在不產(chǎn)生過多焦耳熱的前提下，使用盡可能高的分離電壓，實現(xiàn)最大分離度和最短分析時間。本試驗證明，在電壓增加過程中，蛋白峰型、分離效果均未受到影響，且分離時間縮短，因此選擇30 kV為最佳運行電壓，如圖3所示。

電泳溫度的選擇，主要是指毛細管外表溫度的選擇與控制。溫度變化不僅影響分離的重現(xiàn)性，而且影響分離效果。溫度過高，會使毛細管內(nèi)的溶液過熱而沸騰，甚至于擊穿，故溫度越低越好。由于溫度每改變l℃，將改變黏度2%～3%，因此影響電滲。溫度不恒定，波動大，會導致重現(xiàn)性不好，顧有必要在毛細管柱系統(tǒng)內(nèi)進行恒溫。實際測定中，適度的升高溫度，使緩沖液的濃度減小，淌度增加，會減少遷移時間[17]。由于本文采用的是動態(tài)涂層法，溫度過高會對涂層的影響較大，影響分離效率，此外試驗儀器有一定的降溫功能，經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)25℃分離效果最好。

圖3 不同電壓條件下乳鐵蛋白電泳圖譜

2.4 標準曲線、線性范圍、精密度及檢出限

將質量濃度分別為0.625，1.25，2.5，5，10 g/L的乳鐵蛋白標準品溶液依次分別進樣，得到不同質量濃度乳鐵蛋白電泳圖（圖4）；然后對峰面積進行積分，分別為212482，409297，901800，1995024，4029240；利用儀器自帶分析軟件計算出標準曲線，其線性回歸方程為y=2×10-6x+0.2082，R2=0.9996，線性范圍為0.625～10 g/L（圖5）。分別將質量濃度為0.625，1.25，2.5，5，10 g/L的乳鐵蛋白標準品溶液依次進樣5次，所得的5個濃度遷移時間RSD分別為0.8%，1.1%，0.6%，1.2%和1.5%；峰面積RSD分別為1.2%，1.4%，0.9%，0.8%，1.1%。最低檢出限（S/N=3）為0.03125 g/L。

2.5 原料純度測定結果

將4種已配置好的質量濃度均為5.0 g/L乳鐵蛋白溶液，連續(xù)重復進樣5次，計算得峰面積分別為哥蘭比亞2172226，統(tǒng)園2236522，TATURA2255310，Westland1791031；峰面積RSD分別為1.0%，0.8%，1.2%，0.9%；電泳圖分別為圖6～圖9所示。

圖4 不同質量濃度下乳鐵蛋白電泳結果

圖5 乳鐵蛋白標準曲線線性相關

圖6 乳鐵蛋白A電泳結果

圖7 乳鐵蛋白B電泳結果

3 原料純度的測定

圖8 乳鐵蛋白C電泳結果

圖9 乳鐵蛋白D電泳結果

表1為4種乳鐵蛋白原料純度測定結果。由表1可以看出，毛細管電泳法測定的純度值略低于廠家給定的純度值（HPLC測定）。主要原因是毛細管法分離效率高，HPLC在分離過程中未能將一些雜質峰徹底分離，而毛細管電泳圖中能夠清晰看到（如圖6～圖9中的小峰）。此外，由圖9可以看出，主峰前面小峰分離較徹底，說明部分乳鐵蛋白中鐵飽和度發(fā)生變化，對乳鐵蛋白分子結構產(chǎn)生影響，導致分離較徹底。由此也可以說明本方法在測定蛋白質時，具有高分辨率、靈敏度高等優(yōu)點，是一種有效的蛋白檢測手段。

表1 4種乳鐵蛋白原料純度測定結果

4 結 論

本研究通過動態(tài)涂層法對非涂層毛細管進行了處理，通過對波長、緩沖液及pH值、添加劑等條件的優(yōu)化，在此基礎上采用外標法對4種乳鐵蛋白原料的純度進行了檢測。檢測結果顯示，運用此方法實現(xiàn)了乳鐵蛋白原料的快速檢測，同時解決了蛋白在非涂層管內(nèi)壁吸附的問題，提高了檢測靈敏度，與其他方法相比具有分析時間短、分離效率高、節(jié)省成本等優(yōu)點，適用于乳鐵蛋白原料的入廠檢測。

[1]EVAY P F，VILJOEN M.Lactoferrin：a general review[J].Haematologica，1995，80(3)：252-267.

[2]STEIJNS JM，VAN HOOIJDONK A C.Occurrence，structure，biochemical properties and technological characteristicsof lactoferrin[J]. British Journal of Nutrition，2000，22（6）：168-175

[3]倪丹，王彩云，云戰(zhàn)友.乳鐵蛋白的功能特性研究及應用進展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工：學刊，2011(6)：87-90.

[4]張艷杰.乳鐵蛋白的功能特性及其在嬰兒配方奶粉中的應用[J].中國乳品工業(yè)，2005(2)：33-36.

[5]侯占群，牟德華.乳鐵蛋白及其應用研究進展[J].食品工程，2006(4)：8-11.

[6]張英華，董平.酶聯(lián)免疫法測定牛初乳中乳鐵蛋白含量[J].中國乳品工業(yè)，1999(6)：19-20.

[7]龔廣予，王曉蓉.一種檢測乳鐵蛋白的方法：放射免疫擴散法[J].中國乳品工業(yè)，2001，29(3)：27-29.

[8]INDYK H E，F(xiàn)ILONZIE L.Determination of lactoferrin in bovine milk，Colostrum and infant formulas by opticial biosensor analysis[J]. International Dairy Journal，2005，15：429-438.

[9]唐玲玲，夏明.高效液相色譜法在蛋白質分離檢測中的應用[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學刊).2009(1)：89-92.

[10]夏明，應鐵進.原子吸收分光光度法間接測定奶粉中的乳鐵蛋白含量[J].藥物分析雜志，2011，31(1)：173-175.

[11]許寧.高效毛細管電泳法測定牛乳鐵蛋白的含量[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2005(4)：296-297.

[12]CORRADLNI，CANNARSA G，F(xiàn)ABBRI E.Effeets of alkylamines on electroosmotic flow and Protein migration behaviour in capillary electrophoresis[J].J.Chromatogr，A 1995，709：127-134.

[13]GIORDANO BC，MUZA M，TROUT A.Dynamically coated capillaries allow for capillary electrophoretic resolution of transferring sialoformsvia direct analysis of human serum[J].J.Chromatogr.B，2000，742：79-89.

[14]陳義.毛細管電泳技術及應用[M].2版.北京：化學工業(yè)出版社，2006.

[15]王茜，丁曉靜，王心宇，王廣增.毛細管電泳法快速測定保健食品中免疫球蛋白G[J].分析化學，2006(8)：1161-1164.

[16]李關賓.改善高效毛細管電泳分離效率的若干方法[J].分析儀器，1994(2)：51-54.

[17]朱健萍，胡昌勤，劉文英.毛細管電泳遷移時間重現(xiàn)性影響因素的探討[J].色譜，2006(4)：396-401.

Rapid detection of lactoferrin purity of raw materials by High-Performance Capillary Electrophoresis

LIU Yu，CHEN Wei，SHI Yu-dong，LI Zhi-wei，GAO Zeng-li，HOU Hui-m in，CHEN Yun
(Inner Mongolia Meng Niu Dairy Industry(Group)Co.,Ltd，R&D innovation system，Huhhot，Inner Mongolia 011500，China)

Established a rapid detect method for lactoferrin by Dynamic Coating Capillary Electrophoresis.And use this method detected different raw material purity of lactoferrin.The detection of four kinds of Lactoferrin raw material purity respectively for Glanbia：91.05%，TOONG YEUAN：93.62%，TATURA:94.38%，Westland:75.81%;relative standard deviation(RSD)respectively for 1.0%，0.8%，1.2%and 0.9%.And compared the purity of raw materials provided with the suppliers，discussed the reason of the differences between the two.Results show that the dynamic coating method can effectively restrain the capillary wall adsorption of lactoferrin，is very effective for the detection of Lactoferrin and purity verification，provide a measure for the detection of these proteins.

High-Performance Capillary Electrophoresis；dynamic coating；lactoferrin；purity

TS252.7

：A

：1001-2230（2016）02-0043-04

2015-09-11

劉宇（1985-），男，研發(fā)工程師，主要從事乳制品研究與開發(fā)。

陳云