高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒食品和乳品中葉黃素

,,

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，哈爾濱150028）

高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒食品和乳品中葉黃素

張麗宏,宋戈,亢美娟

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，哈爾濱150028）

建立了高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒食品和乳品中葉黃素的方法。樣品通過(guò)70℃皂化10m in，釋放出葉黃素，正己烷萃取，濃縮后甲醇溶解定容，以甲醇為流動(dòng)相，經(jīng)C18色譜柱分離，用紫外檢測(cè)器于445 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。回收率在96.0%～102.0%，精密度(RSD)為1.95%～3.78%，檢出限分別為0.02μg/g。該方法操作簡(jiǎn)單，精密度好，準(zhǔn)確性高，經(jīng)濟(jì)環(huán)保。

葉黃素；嬰幼兒食品；乳品；高效液相色譜

0 引 言

葉黃素屬于胡蘿卜醇一類(lèi)的色素，具有重要的生理活性，有抗氧化、抗衰老等功能，另外對(duì)視網(wǎng)膜中的黃斑有重要保護(hù)作用。由于葉黃素人體不能自身合成，只能從食物中攝取，國(guó)內(nèi)外出現(xiàn)了添加葉黃素的強(qiáng)化食品。近幾年，國(guó)內(nèi)外對(duì)葉黃素檢測(cè)研究的文獻(xiàn)有很多[1-6]，但都不適用嬰幼兒食品和乳品中葉黃素的測(cè)定。奶粉中葉黃素檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[7]和有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[8-9]中樣品前處理中采用直接提取，而在實(shí)際樣品中添加的葉黃素原料經(jīng)微囊化處理，不易直接提取，而且所用萃取劑容易把其他胡蘿卜醇類(lèi)物質(zhì)提取出來(lái)給測(cè)定帶來(lái)干擾。

本研究通過(guò)優(yōu)化的皂化條件把樣品中的葉黃素完全游離釋放，用合理的萃取劑進(jìn)行提取，建立嬰幼兒食品和乳品中葉黃素的檢測(cè)方法，準(zhǔn)確簡(jiǎn)單。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器設(shè)備

Waters1525高效液相色譜儀配Waters2487紫外檢測(cè)器；氮吹儀；Q L-901型振蕩器。

1.2 色譜條件

葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱(chēng)取葉黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10.0mg,用無(wú)水乙醇定容至10m L容量瓶中,搖勻，配成1.000 g·L-1標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，儲(chǔ)藏于-40℃，使用時(shí)按需要制成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作液；甲醇為色譜純；正己烷；無(wú)水乙醇；氫氧化鉀；抗壞血酸；實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水；以上試劑除標(biāo)注的外均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3柱（250 mm×4.6mm，5 m），柱溫為30℃；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；測(cè)定波長(zhǎng)為445 nm；流動(dòng)相為甲醇；流速為1.0m L/m in。

1.3.2 樣品處理

調(diào)味奶、酸奶和乳飲料：直接吸取1 m L,雪糕、冰激淋：融化后吸取1 m L，移入10 m L帶螺旋蓋的試管稱(chēng)量；果泥、果醬和嬰幼兒配方乳粉：稱(chēng)取0.1 g,移入10 m L帶螺旋蓋的試管，加入30℃左右水1 m L振蕩溶解；面包和嬰幼兒配方米粉：稱(chēng)取2 g移入三角瓶中，加入0.2 g淀粉酶和30℃左右水20 m L,充氮密封后37℃酶解30 m in，吸取1 m L移入10 m L帶螺旋蓋的試管。然后向樣品中加入約0.1 g抗壞血酸和1m L無(wú)水乙醇，混勻，再加入0.5 m L 50%氫氧化鉀水溶液,在70℃水浴中皂化10 m in，涼水冷卻后加入正己烷3 m L，用振蕩器振蕩萃取1 m in，萃取3次，合并萃取液，在40℃下用氮吹儀吹干，加入1 m L甲醇定容，振蕩完全溶解殘留物，在-18℃冷凍30 m in，0.45μm濾膜過(guò)濾,供分析測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 皂化條件的選擇

檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與前處理的好壞直接相關(guān)，而在本試驗(yàn)中前處理的好壞關(guān)鍵在于皂化條件選擇的是否合理。好的皂化條件應(yīng)該滿(mǎn)足既能把被測(cè)物完全從樣品中釋放出來(lái)，又能保證被測(cè)物被破壞的風(fēng)險(xiǎn)最低，損失最小。選擇同一個(gè)均勻的樣品，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。皂化時(shí)都加入0.5 m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%氫氧化鉀溶液和皂化10 m in，在不同溫度下皂化，得到皂化溫度與測(cè)定結(jié)果的關(guān)系圖如圖1(a)，可以確定70℃是最佳皂化溫度。在同一皂化溫度70℃下，都加入0.5 m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%氫氧化鉀溶液后，皂化不同的時(shí)間，得到皂化時(shí)間與測(cè)定結(jié)果的關(guān)系圖如圖1（b）,可以確定在70℃皂化溫度下，皂化10 m in最佳。在同一皂化溫度70℃下，皂化相同的時(shí)間10 m in，加入不同量的堿，得到加入堿的量與測(cè)定結(jié)果的關(guān)系圖如圖1（c）,可以確定在70℃皂化溫度下，皂化10 m in時(shí)，加入堿的量為0.5 m L 50%氫氧化鉀溶液時(shí)最佳。在皂化溫度低、皂化時(shí)間短或加入堿的量少時(shí)皂化不完全，被測(cè)物不能全部從樣品中游離出來(lái)，而皂化溫度過(guò)高、皂化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或加入堿的量過(guò)多被測(cè)物就會(huì)被氧化，損失了。另外通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比皂化樣品和不造皂化樣品兩種前處理，對(duì)添加游離葉黃素醇的樣品，檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有區(qū)別，但對(duì)添加經(jīng)微囊化處理的葉黃素醇酯類(lèi)的樣品，經(jīng)過(guò)皂化前處理的檢測(cè)結(jié)果更接近添加的理論值。故最終選擇加入0.5 m L 50%氫氧化鉀溶液，70℃皂化溫度，皂化10m in的皂化條件。

圖1 皂化溫度、皂化時(shí)間和堿的添加量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

2.2 萃取劑的選擇

被測(cè)物完全從樣品中釋放出來(lái)后，選擇一種恰當(dāng)?shù)娜軇┌驯粶y(cè)物全部提取出來(lái)才能保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。選取3種提取溶劑正己烷、石油醚、乙醚，對(duì)同一個(gè)均勻樣品進(jìn)行萃取。用正己烷作為萃取劑時(shí)，分層效果好，濃縮吹干定容后，殘留物能容易全部溶解，檢測(cè)結(jié)果也最高；其他的提取溶劑在萃取時(shí)不易分層，把其他脂溶性維生素也提取出來(lái)了，濃縮吹干定容后，有殘留物不溶解。而能溶解葉黃素的氯仿和乙醇，沸點(diǎn)高不適合作提取溶劑，故確定正己烷為萃取劑。

2.3 色譜條件的選擇

要保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，好的分離條件也必不可少。與反相C18柱相比，C30柱有更好的分離能力，對(duì)分離類(lèi)胡蘿卜素具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但價(jià)格是C18柱的3到4倍，而且在分離被測(cè)物時(shí)要用到甲基叔丁基醚，氣味大，對(duì)環(huán)境和人都有毒害。樣品經(jīng)過(guò)皂化，正己烷萃取后，得到的分析液雜質(zhì)少，除葉黃素外其他類(lèi)胡蘿卜素沒(méi)有被提取出來(lái)，干擾小，標(biāo)準(zhǔn)樣品、樣品和空白樣品色譜圖如圖2～圖4所示。用反相C18柱，甲醇作流動(dòng)相，進(jìn)行分離完全能達(dá)到分析要求。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢出限

分別配制質(zhì)量濃度為0.001，0.005，0.05，0.1，1.0，10.0，20.0，50.0m g/L的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳色譜條件下，進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定，得到葉黃素回歸方程及線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)、線(xiàn)性范圍，并以3倍信噪比時(shí)的進(jìn)樣濃度計(jì)算出了檢出限如表1所示。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜

圖3 樣品的色譜

圖4 空白樣品的色譜

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、相關(guān)系數(shù)以及線(xiàn)性范圍和檢出限

2.5 回收率和精密度

以同一個(gè)空白樣品為實(shí)驗(yàn)材料，加入一定量的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定8次，得出精密度并以平均測(cè)定值計(jì)算回收率，結(jié)果如表2所示。

表2 葉黃素回收率和精密度（n=8）

由此可見(jiàn)，測(cè)定結(jié)果的較為穩(wěn)定，方法的重復(fù)性較好。

2.6 樣品測(cè)定

按試驗(yàn)方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表3所示。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果

3 結(jié) 論

本文重點(diǎn)研究了皂化條件及萃取劑對(duì)分析測(cè)定的影響，建立了高效液相色譜法測(cè)定嬰兒配方食品和乳品中葉黃素的方法。該方法測(cè)定結(jié)果重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，簡(jiǎn)單易操作，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，適合用于葉黃素的日常檢測(cè)。

[1]石晉,欒雨時(shí),王靜云,等.HP LC法測(cè)定甘薯葉片中的葉黃素[J].植物研究,2008,28(6):767-769.

[2]MARINA V KARLINA，OLGA N POZHARITSKAYA，ALEXANDER N SHIKOV，et al.LC Method for Quantification of Lutein in Rat Plasma:Validation and Application to a Pharmacokinetic Study[J]. Chromatographia,2008,68:949-954.

[3]章清,沈新南,劉珊林.高效液相色譜法測(cè)定血清葉黃素、番茄紅素和β-胡蘿卜素[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2009,31(5):498-501.

[4]XIN-YI HUANG，YE-WEI LIU，DUO-LONG DI,et al.An Improved LC-DAD Method for Simultaneous Determination of Lutein, b-Carotene and Lycopene in Tomato and Its Products[J].Chromatographia,2010,71:331-334.

[5]張茹潭,陳軍輝,史倩,等.非水反相高效液相色譜法測(cè)定海藻中3種葉黃素類(lèi)化合物[J].分析試驗(yàn)室,2012,31(9):13-16.

[6]DOMENICO MONTESANO，ORIELLA GENNARIM，SERENELLA SECCIAM，STEFANIA ALBRIZIO.A Simple and Selective Analytical Procedure for the Extraction and Quantification of Lutein from Tomato By-Products by HPLC-DAD[J].Food Anal，Methods, 2012,5:710-715.

[7]GB/T23209-2008奶粉中葉黃素的測(cè)定液相色譜-紫外檢測(cè)法[M].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

[8]單藝,楊金寶,鄂來(lái)明,等.反相高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒配方食品中的葉黃素[J].食品科技,2011,36(10):276-279.

[9]高迎春,尹伶靈,陳玲,等.高效液相色譜法測(cè)定乳制品中的葉黃素[J].中國(guó)乳品工業(yè),2012,40(4):48-50.

[10]高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒食品和乳品中的葉黃素、α-胡蘿卜素和β－胡蘿卜素[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2012,22(9): 2043-2045.

Determination of lutein in foods for infants and dairy products by high-performance liquid chromatographic

ZHANG Li-hong,SONG Ge,KANG Mei-juan
(National Dairy Testing Center,Northeast Agriculture University,Harbin 150028,China)

A simple and rapid method for determination of lutein in foods for infants and dairy products by high-performance liquid chromatography(HPLC)was developed.Following a mild saponi cation procedure(70℃for 10min)demonstrated to be benign to lutein,lipophilic components were partitioned by a single extraction into hexane and concentrated in mobile phase.Separation of lutein was achieved using a C18 column and isocratic elution with methanol and detected at445 nm with a ultraviolet detector.The recovery were 96.0%～102.0%,the relative standard deviations(RSD)were 1.95%～3.78%,the minimum detectable values were 0.02μg/g.This method can be used for the routine analysis of lutein.

lutein;foods for infants;dairy products;HPLC

TS252.7

：A

：1001-2230（2016）02-0047-03

2015-09-15

張麗宏（1975-），女，工程師，從事乳制品檢測(cè)與研究。