急性白血病患者外周血T細胞亞群、NK細胞和調節性T細胞的檢測及臨床意義

張司琪，葛 健，夏瑞祥

急性白血病患者外周血T細胞亞群、NK細胞和調節性T細胞的檢測及臨床意義

張司琪，葛 健，夏瑞祥

目的了解急性白血病（AL）患者外周血 T淋巴細胞亞群、自然殺傷（NK）細胞和調節性 T細胞（Treg）的水平及不同時期的變化，并探討其臨床意義。方法采用流式細胞術對 AL初診患 者 （93例 ）、異 基因 造 血 干細 胞 移 植 （Allo-HSCT）者（9例）及正常健康對照者（30例）外周血 CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+／CD8+比值、NK細胞和 CD4+CD25+CD127lowTreg進行 檢測。結果初診 AL患者 CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD4+／CD8+比值和 NK細胞低于正常對照者（P＜0.05），Treg細胞高于正常對照者（P＜0.05）；AL患者治療后達完全緩解（CR）者 CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD4+／CD8+比值、NK細胞及 Treg細胞可逐漸恢復，但 NK細胞恢復緩慢，Treg細胞在緩解早期較治療前增高，但差異無統計學意義；Allo-HSCT患者 CD4+T細胞水平和 CD4+／CD8+比值明顯低于正常對照者（P＜0.05），CD8+T細胞水平明顯高于正常對照者（P＜0.05）。結論AL患者存在細胞免疫功能紊亂，動態檢測 T淋巴細胞亞群、NK細胞及 Treg對了解 AL患者細胞免疫功能及免疫調節治療有一定的臨床價值。

急性白血病；T淋巴細胞亞群；NK細胞；調節性 T細胞

急性白血病（acute leukemia，AL）是起源于造血干細胞的克隆性惡性血液病，其發生發展與機體免疫紊亂密切相關，尤其是細胞免疫異常。T淋巴細胞和自然殺傷（natural killer，NK）細胞是細胞免疫的重要組成部分，在抗腫瘤效應中發揮重要作用。調節性 T細胞（regulatory T cell，Treg）有免疫調節功能，在腫瘤環境中能夠抑制抗腫瘤免疫。該研究對93例初診 AL患者、9例異基因造血干細胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，Allo-HSCT）患者和 30例健康對照者進行外周血 T淋巴細胞亞群、NK細胞及 Treg細胞水平進行檢測，并動態觀察其在AL患者治療前后的變化。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取 2014年 7月 ～2015年 6月于安徽醫科大學第一附屬醫院血液內科確診的93例初診 AL患者（AML 73例，ALL 17例，MPAL 3例），其中男 56例，女 37例，年齡 14～84（50.7± 17.57）歲；9例 AL Allo-HSCT者，其中男 7例，女 2例，年齡 25～43（30.67±6.38）歲。正常對照者 30例，其中男 17例，女 13例，年齡 21～54（32.13± 10.00）歲，均為醫院體檢中心健康體檢者。

1.2 主要試劑和儀器鼠抗人單克隆抗體：CD4-PB、CD8-APC、CD3-FITC／CD（16+56）PE、CD45-KO、CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE，溶血素，磷酸鹽緩沖液（PBS），水平離心機，旋窩振蕩器，Navios流式細胞儀（美國 Beckman Coulter公司）。

1.3 標本的制備清晨收集研究對象空腹外周靜脈血 3 ml，置于肝素抗凝管中，混勻后取 2 ml于離心管，置離心機中，1 500 r／min離心 5 min，吸除最上層血漿后充分混勻。取兩支 BECKMAN離心管，各加入混勻的去血漿抗凝血 100μl，分別編號為試管 1和試管 2，試管 1中加入 10μl CD4-PB、CD8-APC、CD3-FITC／CD（16+56）PE、CD45-KO，試管 2中加入 10μl CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE，渦旋混勻，室溫避光放置 15 min。取出后向兩支試管中各加入 1 ml溶血素，旋窩混勻，避光放置 15 min。取出置離心機中，1 500 r／min離心 5 min后，棄去上清液，各加入 0.5 ml PBS溶液旋窩混勻后直接上機，每管收集 2 000個淋巴細胞。

1.4 T淋巴細胞亞群及NK細胞的檢測方法（試管1）首先在 FSC-SSC散點圖上圈定淋巴細胞群，以CD45+／SSC射門，選擇 CD45陽性且SSC較小的細胞區，其中 CD3陽性且 CD4陽性者為CD4+T細胞群，CD3陽性且 CD8陽性者為 CD8+T細胞群，CD3不表達且 CD（16+56）高表達者為 NK細胞，檢測結果以各類細胞占總淋巴細胞的百分率表示。

1.5 Treg的檢測方法（試管2）首先在 FSC-SSC散點圖上圈定淋巴細胞群，再以 CD4+／SSC射門，選擇 CD4陽性且 SSC較小的細胞區，其中 CD25陽性而 CD127低表達者為 CD4+CD25+CD127lowTreg。

1.6 統計學處理應用 SPSS 19.0統計軟件進行分析，數據用 ˉx±s表示；多組均數的比較采用方差分析，方差齊時采用 LSD檢驗，方差不齊采用 Dunnett′s T3檢驗兩兩比較各組間差異。

2 結果

2.1 AL患者基本情況93例初診 AL患者誘導治療后完全緩解（CR）者 55例，部分緩解（PR）者 9例，未緩解者 19例，死亡者 3例，放棄治療者 7例。55例 CR者為 AL CR（1個月）組。3個月后仍 CR者 49例，復發兩例，失訪 4例，該 49例為 AL CR（3個月）組。19例未緩解者為 AL未緩解組。

2.2 A llo-HSCT者基本情況9例 AL Allo-HSCT者為 AL移植組，均為移植 3～18個月后來我院復查患者，其造血干細胞來源分別為親緣全相合6例，親緣非全相合移植 2例，非親緣臍血干細胞移植 1例。檢測時患者均處于 CR狀態，其中 3例患有慢性移植物抗宿主病（chronic graft-versus-host disease，cGVHD），兩例表現以皮疹為主，1例表現以腹瀉及肝功能異常為主。

2.3 T淋巴細胞亞群檢測結果初診 AL組、AL CR（1個月）組、AL CR（3個月）組、AL未緩解組、AL移植組和正常對照組 T細胞亞群的具體檢測結果見表 1，其中 CD3+T細胞水平、CD4+T細胞水平和 CD4+／CD8+比值滿足方差齊性，6組間均數差異均有統計學意義（F=6.538、28.513、17.348，P＜0.05），CD8+T細胞水平不滿足方差齊性，6組間均數差異有統計學意義（F=22.498，P＜0.05）。組間兩兩比較結果顯示：初診 AL組和 AL未緩解組CD3+T細胞百分比、CD4+T細胞百分比、CD4+／CD8+比值均明顯低于正常對照組（P＜0.05），CD8+T細胞百分比均高于正常對照組，但差異無統計學意義；AL CR（1個月）組及 AL CR（3個月）組患者T淋巴細胞亞群與正常對照組無明顯差異，CD3+T細胞百分比、CD4+T細胞百分比、CD4+／ CD8+比值均高于初診 AL組（P＜0.05），CD8+T細胞百分比低于初診 AL組，但差異無統計學意義；AL移植組 CD3+T細胞百分比與正常對照組無明顯差異，CD4+T細胞百分比、CD4+／CD8+比值均明顯低于正常對照組（P＜0.05），CD8+T細胞百分比明顯高于正常對照組（P＜0.05）。見表1。

2.4 NK細胞檢測結果各組 NK細胞占總淋巴細胞的 百 分 率 分 別 為：初 診 AL組 （11.84% ± 6.65%），AL CR（1個月）組（12.34% ±7.18%），AL CR（3個月）組（14.96% ±7.40%），AL未緩解組 （11.87% ±7.22%），AL移 植 組 （16.33% ± 6.67%），正常對照組（16.30% ±6.10%），滿足方差齊性，6組間均數差異有統計學意義（F=3.319，P＜0.05）。組間兩兩比較結果示：初診 AL組和 AL未緩解組NK細胞百分比均明顯低于正常對照組（P＜0.05）；AL CR（1個月）組 NK細胞百分比仍低于正常對照組（P＜0.05）；初診 AL組和 AL CR（1個月）組 NK細胞水平無明顯差異；AL CR（3個月）組NK細胞百分比接近正常對照組，高于初診 AL組（P＜0.05）；AL移植組 NK細胞百分比與正常對照組無明顯差異。見表1。

2.5 Treg檢測結果各組 Treg細胞占 CD4+T細胞的百分率分別為：初診 AL組（8.31% ±3.74%），ALCR（1個月）組（9.67% ±3.81%），AL CR（3個月）組（6.69% ±2.99%），AL未緩解組（10.33% ± 3.52%），AL移植組（6.83% ±3.85%），正常對照組（6.33% ±2.62%），不滿足方差齊性，6組間均數差異有統計學意義（F=6.536，P＜0.05）。組間兩兩比較結果示：初診 AL組、AL CR（1個月）組及 AL未緩解組 Treg百分比明顯高于正常對照組（P＜0.05）；AL CR（1個月）組及未緩解組 Treg百分比均高于初診 AL組，但差異無統計學意義；AL CR（3個月）組 Treg百分比與正常對照組無明顯差異，明顯低于 AL CR（1個月）組（P＜0.05）及 AL未緩解組（P＜0.05）；AL移植組 Treg水平與正常對照組無明顯差異。見表1。

3 討論

T淋巴細胞有輔助功能、殺傷功能和抑制功能，其各亞群之間的平衡狀態與機體的免疫功能密切相關。CD3是 T細胞表面的重要標志，CD3+細胞可用于計數 T淋巴細胞總數。T細胞亞群包括 CD4+T細胞群和 CD8+T細胞群。CD4+T細胞亞群有免疫協調功能，CD8+T細胞亞群有免疫抑制作用和殺傷靶細胞的功能，CD4+／CD8+比例穩定對維持細胞免疫反應平衡至關重要。本實驗結果顯示 AL患者CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD4+／CD8+比值均明顯低于正常對照組，提示 AL患者存在 T淋巴細胞平衡紊亂，細胞免疫功能受到抑制。AL CR患者 T細胞亞群各抗原比例接近正常，提示機體細胞免疫功能得到一定程度的恢復。化療是治療 AL的常規手段，Allo-HSCT是 AL患者長 期存活 的有效 治療方法。研究［1］顯示，化療對細胞免疫有抑制作用，免疫調節劑（如 IL-2）能夠改善化療后白血病患者 T細胞亞群水平。Allo-HSCT患者通過大劑量化療預處理，再回輸供者造血干細胞，重建免疫系統，并且需長期使用激素和免疫抑制劑，以防治 GVHD。國內外研究［2-3］顯示，Allo-HSCT患者移植后 CD8+T細胞恢復較快，CD4+T細胞恢復較慢，導致 CD4+／CD8+比值 長 期 倒 置。本 實 驗 結 果 顯 示 AL Allo-HSCT患者 CD4+T細胞比值明顯降低，CD8+T細胞比值明顯增高，CD4+／CD8+比值嚴重倒置，與研究［2-3］結果一致，提示 AL患者移植后機體細胞免疫功能長期處于抑制狀態。

表1 AL患者 T淋巴細胞亞群、NK細胞及 Treg水平（ˉx±s）

NK細胞有細胞毒功能和免疫調節功能，是感染和抗腫瘤免疫的第一道天然防線［4］。一項對 42例 AL患兒的研究［5］顯示，AL患兒在疾病發生和治療過程中存在細胞免疫功能異常，治療并獲得 CR后，患兒細胞免疫功能可逐漸恢復，但 NK細胞水平恢復緩慢，獲得 CR一年后 NK細胞水平仍未達到正常。本研究結果顯示 AL初診患者 NK細胞水平低于正常對照者，提示初診 AL患者 NK細胞免疫功能受損，AL CR患者誘導治療 1個月后 NK細胞水平未見明顯升高，誘導治療 3個月后接近正常，提示NK細胞恢復速度相對緩慢，與上述研究［5］結果一致。

Treg有免疫抑制性和免疫無能性，其增高或減低與多種機體病理狀態相關。Treg細胞高表達可能與多種惡性腫瘤性的不良預后相關［6］，而低表達則與免疫性血小板減少癥、潰瘍性結腸炎等多種免疫相關性疾病相關［7-8］。研究［9］表明 Treg可以抑制抗腫瘤免疫。本研究顯示 AL初診患者 Treg較正常對照者明顯增高，提示 AL患者抗腫瘤免疫受到抑制。而本研究中 ALCR（1個月）組及 AL未緩解組Treg細胞均高于治療前水平，但差異無統計學意義，提示AL患者誘導治療后機體免疫可能進一步受抑。可能是因為化療本身對機體免疫功能有負作用。Treg細胞水平還與 aGVHD相關。Magenau et al［10］的臨床實驗提示 Treg細胞水平可作為 aGVHD的生物預測標志。傅華睿 等［11］發現，Allo-HSCT患者在血象恢復后3～5 d，Treg／CD4+T細胞比例小于7% 時，發 生 aGVHD 的 風 險 增 大。本 實 驗 Allo-HSCT者均為移植 3個月后 AL患者，其 Treg水平與正常對照者無明顯差異，可能是因為病例數較少，以及未對移植患者進行無 GVHD和 cGVHD分組比較相關。早期和動態監測移植患者 Treg細胞水平可進一步了解 Allo-HSCT患者免疫重建過程及細胞免疫水平。

Treg細胞可能參與 T細胞亞群和 NK細胞的調節。研究［12］顯示，Treg可以通過促進 CD8+T細胞免疫應答，抑制 NK細胞免疫應答，參與急性髓系白血病的發生發展。本實驗結果顯示 AL初診組 Treg細胞水平高于正常對照組，NK細胞水平低于正常對照組，AL CR（3個月）組 Treg細胞及 CD8+T細胞水平降低，NK細胞水平升高。但 AL CR（1個月）組Treg細胞百分比較治療前稍升高，而 NK細胞水平未見下降，CD8+T細胞水平未見升高，提示 Treg細胞與 CD8+T細胞、NK細胞并非絕對相關，其之間的關系及機制有待進一步的研究。

綜上所述，AL患者在疾病發生及治療過程中存在細胞免疫功能紊亂，經治療并獲得 CR后細胞免疫功能可逐漸恢復。動態檢測 T淋巴細胞亞群、NK細胞及 Treg可反應機體細胞免疫水平，臨床上對了解患者細胞免疫功能及免疫調節治療有一定價值。治療過程中根據患者 T淋巴細胞亞群、NK細胞及Treg水平，適當應用免疫調節劑可能有助于患者恢復。

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Detection of T lymphocyte subsets，NK cells，regulatory T cells in peripheral blood of patientswith acute leukem ia and its clinical significance

Zhang Siqi，Ge Jian，Xia Ruixiang
（Dept of Hemotology，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

Objective To study the levels of T lymphocyte subsets，NK cells，regulatory T cells in peripheral blood of patients with acute leukemia，and the changes in different periods，and to explore its clinical significance. Methords To detect the level of peripheral blood of CD3+T cells，CD4+T cells，CD8+T cells，CD4+／CD8+ratio，NK cells and CD4+CD25+CD127lowTreg in 93 newly diagnosed AL patients，9 AL patients after Allo-HSCT and 30 normal controls by using flow cytometry.Resu lts The percentages of CD3+T cells，CD4+T cells，NK cells and the ratio of CD4+／CD8+in newly diagnosed AL patients were much lower than the normal controls（P＜0.05），and Treg in newly diagnosed AL patientswasmuch higher than the normal controls（P＜0.05）.The levels of CD3+T cells，CD4+T cells，CD4+／CD8+ratio，NK cells and Treg in the patients achieved CR were gradually close to the normal controls.But the recovery rate of NK cells was slow，and the level of Treg in early CR period was increased than that of before induction therapy，but it had no statistically significant difference.The level of CD4+T cells and the ratio of CD4+／CD8+in the group of Allo-HSCTwere significantly lower than the normal controls（P＜0.05），and the level of CD8+T cells in the group of Allo-HSCT was significantly higher than the normal controls（P＜0.05）.Conclusion Cellular immune function is disordered in patientswith AL.Dynamic detection of T lymphocyte subsets，NK cells，regulatory T cells are clincially value on investigating cellular immune function and immune regulation therapy in patientswith AL.

acute leukemia；T lymphocyte subsets；NK cells；regulatory T cells

R 733.71

A

1000-1492（2016）02-0218-04

時間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.030.htm l

2015-11-06接收

國家自然科學基金（編號：81200371）；高等學校博士學科點專項科研基金聯合資助課題（新教師類聯合資助課題）（編號：20123420120011）；安徽省自然 科學基金（編號：1208085QH154）

安徽醫科大學第一附屬醫院血液內科，合肥 230022

張司琪，女，碩士研究生；

葛 健，男，副教授，副主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：gejian77＠medmail.com.cn；

夏瑞祥，男，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：xrx2041＠163.com