ITF2的表達水平與胃癌轉移相關

徐佳慧，胡世蓮，沈國棟，翁海燕，徐婷娟，沈 干

ITF2的表達水平與胃癌轉移相關

徐佳慧1，2，胡世蓮1，2，沈國棟1，2，翁海燕3，徐婷娟1，2，沈 干1，2

目的探討免疫球蛋白轉錄因子 2（ITF2）在胃癌中的表達水平和臨床意義。方法收集 42例胃腺癌和 20例良性胃黏膜組織蠟塊，應用免疫組化 SP法檢測臨床標本中ITF2的蛋白表達水平，并分析其表達量與患者臨床病理各參數之間的關系。另以胃腺癌細胞 HSC44-PE與 44As3以及人 胃 黏 膜 上 皮 細 胞 系 GES-1為 研 究 對 象，使 用 Western blot法 檢 測 細 胞 中 ITF2表 達 水 平，劃 痕 實 驗 方 法 檢 測HSC44-PE與 44As3細胞的轉移能力。結果惡性組織中ITF2蛋白表達強度明顯高于良性組織，兩者間差異有統計學意義（Z=-2.401，P＜0.05）；伴隨有淋巴結轉移的胃癌組織中 ITF2表達量明顯高于無轉移病例，且隨著腫瘤浸潤深度、TMN分期的升高而升高（P＜0.05）；但與年齡、性別和腫瘤分化程度差異均無統計學意義；ITF2表達量高的胃癌細胞 44As3轉移潛能明 顯高于轉移潛能較低的胃癌細胞HSC44-PE和正常 胃上皮細胞 GES-1（P＜0.05）。結論ITF2在胃癌組織中呈高表達，尤其與腫瘤轉移潛能相關，提示該蛋白可能參與胃癌的發生和發展，并可能成為胃癌進展的監測指標。

胃癌；ITF2；表達；轉移

胃癌是源自胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是五大最常見癌癥之一，胃癌在我國發病率很高，其致死率占惡性腫瘤的第二位，僅次于肺癌［1］。腫瘤的轉移和復發往往是導致預后不良的重要因素，其發生分子機制十分復雜，通常涉及多基因、多階段、多因素參與。該過程常常伴隨著癌性信號通路的激活與抑癌性通路的失活，這往往是癌癥發生發展過程中兩個重要的分子機制。研究［2-4］證明異常活化的 Wnt／β-catenin信號通路涉及胃癌等多種實體腫瘤的發生和轉移。免疫球蛋白轉錄因子 2（immunoglobulin transcription factor 2，ITF2）是 堿 性 螺 旋 -環 -螺 旋（basic helix-loop-helix，bHLH）結構蛋白家族的轉錄因子之一，其功能主要參與早期發育過程中的中樞神經系統形成以及成年期的淋巴細胞、肌肉和胃腸道等系統的發育［5-6］。近年來有研究［7］表明 ITF2是癌性通路 Wnt信號通路下游的靶基因。該研究旨在探討 ITF2在胃癌的發生發展以及在轉移中所發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 組織收集安徽醫科大學附屬省立醫院 2009年1月 ～2014年 12月病理科存檔的胃癌（腺癌）大標本蠟塊 42例，其中男31例，女 11例，年齡 29～81歲，中位年齡 64.5歲。按照 2010年日本胃癌學會（JGCA）的 TNM分期標準，其中Ⅰ期 +Ⅱ期 18例，Ⅲ期 +Ⅳ期 24例；腫瘤浸潤局限于黏膜下層（T1+ T2）15例，浸潤至肌層以及漿膜層（T3+T4）27例；高／中分化 23例，低分化 19例；有淋巴結轉移 22例，無淋巴結轉移20例。另取胃部分切除吻合口正常組織和慢性淺表性胃炎組織共 20例作為良性對照。所有組織標本經兩位副主任以上醫師核實，組織臨床病理數據齊全。

1.2 設備和試劑電烘箱（上海三發科學儀器公司）；Olympus IX71倒 置 顯微鏡 （日 本 Olmypus公司）；離心機（德國 Eppendorf公司）；化學發光成像儀成像和 Chemi Analysis分析軟件 （上海 ChemiS-cope公司）；枸櫞酸、PBS粉劑（武漢博士德生物公司）；兔抗人 ITF2多克隆抗體（英國 Abcam公司）；小鼠抗人 β-actin單克隆抗體、HRP標記的山羊抗小鼠 ／兔 IgG（美國 Cell Signaling Technology公司）；山羊血清、PV6000通用型二步法檢測試劑盒和二氨基聯苯胺（DAB）顯色劑（北京中杉金橋生物技術有限公司）；RIPA（弱）裂解液、loading buffer（上海碧云天生物技術有限公司）；蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑（瑞士 RoChe公司）；BCA蛋白試劑盒、Western blot顯 影 液 （美 國 Thermo scientific公 司 ）；人胃黏膜上皮細胞系 GES-1購自上海細胞庫；人胃腺癌細胞株 44As3及 HSC44-PE由日本名古屋大學武井佳史教授贈送；DMEM和 RPMI1640培養基（美國 HyClone公司）；5%BSA由 1.5 g脫脂奶粉和 30 m l TBST配制。

1.3 免疫組化及評分標準將由甲醛固定、石蠟包埋后的切片行 2μm連續切片，經免疫組化 SP法：在電烘箱內以 60℃的條件烘烤 10～20 min后，放入二甲苯中脫蠟以及梯度酒精中脫水，在枸櫞酸（pH7.2）溶液中通過高溫高壓的方式用進行抗原修復，自然冷卻至室溫，經 3%的過氧化氫溶液清除內源性氧化酶，用山羊血清室溫封閉 30 min，棄去，加入 ITF2抗體工作液（1∶150）4℃過夜，次日經 PBS（pH7.2）洗凈后，二抗孵育 1 h，DAB染色劑，染色時間控制在 6 min以內，清水終止，放入蘇木精中復染，最后進行梯度酒精二甲苯脫水透明化，進行封片，并在顯微鏡下評分。同時每一位患者的石蠟切片均通過 HE染色，由病理科醫師重新鑒別組織類型。結果判斷：ITF2蛋白以細胞染色呈淡黃色至棕褐色顆粒為陽性，免疫組化評分根據陽性細胞百分比和染色強度綜合評分。① 陽性細胞比例評分標準：染色比例 ＜5%為 0分；5% ～25%為 1分；25%～50%為 2分；50% ～75%為 3分，≥75%為 4分；② 染色強度評分標準：無染色為 0分；淡黃色為 1分；明顯的黃棕色為 2分；強棕褐為 3分。鏡下（× 400）隨機選取 5個視野，以 5個視野陽性細胞比例與染色強度評分的乘積最后的平均值為最后得分。以最后分值≥2視為陽性，其中 2～4分為弱陽性，≥4為強陽性。

1.4 細胞培養GES-1在 含 10% 胎 牛 血 清 的DMEM中培養，人胃癌細胞株 44As3及 HSC44-PE使用含 10%胎牛血清的 RPMI1640培養基。以上細胞均在37℃、5%CO2培養箱內培養。

1.5 Western blot以及數據分析待細胞貼壁并長至 70% ～80%滿度，經預冷的 PBS清洗后，加入裂解液 RIPA（弱）、蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑混合物置于冰上反應 30 min；經 4℃預冷的離心機，15 000 r／min離心 10 min，取上清液細胞總蛋白，通過 BCA試劑盒測 定 蛋 白 濃 度；加入 loading buffer，100℃ 煮 沸 10 min，高 溫變性后 用 于 SDSPAGE電泳。電轉后的 PVDF膜用 5%BSA室溫封閉 1 h，加入小鼠抗人 β-actin工作液（1∶1 000）或兔抗人 ITF2多克隆抗體工作液（1∶500）4℃過夜。次日，充分洗膜后加入 HRP標記的山羊抗小鼠／兔IgG工作液（1∶1 000）室溫孵育 1 h。以上抗體均使用5%BSA封閉劑稀釋。滴加免疫印跡顯影液，使用化學發光成像儀成像并用 Chemi Analysis分析軟件對蛋白電泳條帶灰度值進行定量分析。蛋白相對定量 =目的蛋白灰度值 ／同標本 β-actin內參灰度值。

1.6 細胞劃痕將胃癌細胞 44As3和 HSC44-PE接種到6孔板中，待細胞貼壁并長至 80%滿度，用200μl槍頭尖端劃出痕跡，同時保證軌道寬度保持一致，用無菌 PBS清洗 3遍，以清除脫落細胞，重新加入新鮮無血清培養基，分別于 0、14 h在顯微鏡下進行拍照，觀察劃痕愈合情況并測量。

1.7 統計學處理SPSS 22.0軟件對數據進行統計學分析，Western blot蛋白相對定量值和劃痕實驗遷移運動面積采用獨立樣本 t檢驗，胃癌中 ITF2蛋白免疫組化評分結果在良性組織和惡性組織表達差異采用 Mann-Whitney U檢驗，ITF2表達陽性率與胃癌患者臨床病理特征的關系通過 χ2檢驗。

2 結果

2.1 ITF2在良性組織與惡性組織中表達水平

ITF2大部分表達于細胞質，一部分表達于淋巴細胞、結締組織，20例良性組織中有 8例陽性，其中有5例呈弱陽性，3例呈強陽性。42例惡性組織中有30例表達陽性，其中 23例呈弱陽性，7例呈強陽性。良性組織與惡性組織之間的表達差異有統計學意義（Z=-2.401，P＜0.05）。見圖1。

圖1 良性組織與惡性組織中 ITF2的表達情況 SP×200 A：良性組織中；B：惡性組織

2.2 ITF2蛋白的表達水平與胃癌生物學特征之間的關系本實驗結果表明，ITF2在有淋巴結轉移的腫瘤中表達陽性率比無淋巴結轉移病例更高，并隨著 TNM分期、腫瘤浸潤深度的增加而增加，Ⅰ +Ⅱ期和Ⅲ +Ⅳ期、T1+T2和 T3+T4差異有統計學意義（P＜0.05），ITF2的表達與胃癌患者年齡、性別、分化差異均無統計學意義。見表1。

2.3 ITF2表達水平與腫瘤細胞轉移相關為了探討 ITF2在 胃 癌 細 胞 中 的 表 達 情 況，通 過 Western blot檢 測 GES-1、44As3和 HSC44-PE中 的 表 達 水平，顯示 ITF2在正常細胞中的表達量明顯低于胃癌細胞（P＜0.05），胃癌細胞 44As3明顯高于 HSC44-PE（P＜0.05），見圖2。

表1 ITF2在胃癌的表達與臨床各病理參數之間的關系

圖2 W estern blot檢測 ITF2在 GES-1、44As3和HSC44-PE細胞中的表達量與 GES-1比較：*P＜0.05；與 HSC44-PE比較：＃P＜0.05

2.4 44As3轉移潛能高于HSC44-PEWestern blot結果顯示 44As3中 ITF2的表達量高于 HSC44-PE。為了探討 ITF2對細胞運動性的影響，通過細胞劃痕實驗檢測該兩種細胞的轉移能力，44As3轉移能力明顯高于 HSC44-PE，差異有統計學意義（t= -25.142，P＜0.05），見圖3。

圖3 劃痕實驗檢測 44As3與 HSC44-PE的轉移性 ×100A：HSC44-PE；B：44As3；1：0 h；2：14 h；與 HSC44-PE比較：*P＜0.05

3 討論

由于胃癌早期臨床癥狀特異性低和無有效的監測指標，近半數患者在確診時多已處于進展期，往往發生局部或遠處轉移，從而失去了最佳治療時期。因此，胃癌的病程是影響預后最重要的因素之一，目前胃癌轉移進展的分子機制尚未完全闡明。值得關注的是，與人體細胞生命活動息息相關的細胞信號通路調節過程一旦出現偏差，往往導致疾病的發生發展。

Wnt信號通路是調控胚胎發育和機體器官發育的重要信號通路，其在細胞增殖、分化等方面發揮作用。研究［8-9］顯示 Wnt信號通路在多種腫瘤中呈異常激活狀態，伴隨著大量 β-catenin／TCF4轉錄復合物的形成，激活下游與癌癥相關的靶基因，從而可能促進腫瘤轉移。ITF2是 bHLH蛋白結構家族的轉錄因子，主要參與胚胎中樞神經系統、體節和性腺嵴的形成，并且可能參與淋巴細胞、胃腸道、甲狀腺和腎臟等發育［5-6］。在此之前 ITF2基因的異常主要導致精神分裂等中樞神經疾病［10］。近年來，科學家開始探討 ITF2在癌癥中發揮的作用，發現該基因是Wnt信號通路的下游靶基因，并且可能參與了腫瘤的發生發展［7，11］。Vincent et al［12］在肺癌骨轉移模型細胞中發現 ITF2呈高表達，并且在后期的研究中發現其能夠賦予親代細胞骨轉移能力，再一次確認了其在促進腫瘤轉移中的可能性。

為了探索 ITF2在胃癌發生發展中的作用，本實驗首先通過免疫組化檢測其在 42例胃惡性組織與20例良性組織的表達情況，并分析了其表達量與臨床病理參數之間的關系，結果提示惡性組織中 ITF2蛋白表達陽性程度明顯高于良性組織，二者差異有統計學意義，其表達水平與腫瘤浸潤程度，淋巴結轉移、以及腫瘤 TMN分期有關、與年齡、性別、分化因素之間無顯著相關。采用 Western blot檢測 ITF2在胃癌細胞 44As3、HSC44-PE和 GES-1中的表達 水平，發現該蛋白在胃癌細胞中的表達水平明顯高于正常細胞，且在 44As3高于 HSC44-PE。同時通過細胞劃痕實驗檢測胃癌細胞株 44As3、HSC44-PE的轉移能力，結果提示前者的轉移能力明顯高于后者，這與免疫組化結果一致。綜上所述，ITF2在胃癌中大多呈陽性表達，其表達水平與胃癌的轉移能力有關，提示其可能成為一種用于胃癌預后評估的分子標志物。

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Levels of ITF2 in gastric cancer and functionally associated w ith metastasis

Xu Jiahui1，2，Hu Shilian1，2，Shen Guodong1，2，et al
（1Dept of Geriatrics，Anhui Provincial Hospital Affiliated to AnhuiMedical University，2Anhui Provincial Key Laboratory of Tumor Immunotherapy and Nutrition Therapy，Hefei 230001）

Objective To explore the levels and clinical significance of immunoglobulin transcription factor 2（ITF2）in gastric cancer.Methods Expression of ITF2 in 42 malignant tumor samples and 20 benign tissueswas detected by immunohistochemistry，and the association of ITF2 with clinicopathological characteristics was statistically analyzed.The role of ITF2 in cancer cells 44As3，HSC44-PE and human gastric epithelial cell line GES-1was tested byWestern blot，themotility of cancer cellswasdetermined bywound healing assay.Results ITF2 was overexpressed in themalignant tissues then benign tissues（Z=-2.337，P＜0.05）；statistical analysisofassociation of ITF2 expression with clinicopathological characteristics revealed that expression of ITF2 was associated with TNM stage，lymph nodemetastasis and invasion（P＜0.05）；expression of ITF2 was not statistically differentwith age，sex and differentiation degree；expression of ITF2 in 44As3 was higher than the HSC44-PE and GES-1（P＜0.05），while the metastasis potentialwas positively correlated with ITF2 expression（P＜0.05）.Conclusion ITF2 in gastric cancer shows high expression，especially with metastasis potential，suggesting that this protein may be involved in the occurrence and development of gastric cancer，could be an indicator formonitoring progression.

gastric cancer；ITF2；expression；metastasis

R 735.2

A

1000-1492（2016）02-0284-05

時間：2016-1-20 10：32：27

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.062.htm l

2015-11-17接收

國家自然基金資助項目（編號：81071808）；安徽省自然基金項目（編號：1408085MH167）；安徽省科技攻關項目（編號：1301042094）

安徽醫科大學附屬省立醫院1老年病科、2腫瘤免疫與營

養治療安徽省重點實驗室、3病理科，合肥 230001

徐佳慧，女，碩士研究生；

沈 干，男，教授，碩士生導師，責 任作 者，E-mail：shenganustc＠163.com