提取油茶籽抗氧化活性物質的研究

◎ 曾麗珠，李 軒，張 昊

（陽江出入境檢驗檢疫局，廣東 陽江 529500）

1 研究背景

1.1 油茶籽的應用價值

油茶（Camellia oleiferaAbel）隸屬于山茶科（Theacese）山茶屬（CamelliaL），是我國特有的食用油料樹種，脂肪酸組成與在西方被譽為“液體黃金”的橄欖油相似，長期食用茶油，具有預防心腦血管疾病、抗肝炎、抗衰老、防癌抗癌等功效。而油茶籽油具有多種功效，歸功于其含有多種功能性成分，如角鯊烯、茶多酚、山茶皂甙、山茶甙等活性物質[1]。

目前，國內外使用較多的是合成抗氧化劑，如沒食子酸丙酯（PG）、二叔丁基羥基甲苯（BHT）、叔丁基對苯二酚（TBHQ）或丁基羥基茴香醚（BTA）等[2]，但隨著人們食品安全意識的提高，對合成添加劑的添加提出了質疑。從油茶籽中提取出高效安全低毒的抗氧化活性物質，成為進一步開發天然高效食品抗氧化劑的重要途徑。

1.2 亞臨界萃取技術的應用

傳統的油茶籽油的提取工藝主要有壓榨法、有機溶劑浸提法、水蒸氣蒸餾法、油脂分離法等，新型的提取工藝則有超臨界萃取法[3]和亞臨界萃取，顯然前幾種的提取方法都會一定程度上影響茶油的成率和品質，超臨界CO2提取茶籽油盡管產品質量好、得率高，但設備要求高，一次性資金投入較大。而亞臨界萃取作為其中一種新型提取工藝，有著條件相對溫和，對高壓設備要求不苛刻和成本更低的優點。

1.3 研究的目的與意義

本文通過提取油茶籽中不同極性物質，對不同極性的萃取物質進行總酚含量的測定，并利用油茶籽油中不同極性萃取物進行自由基清除能力試驗，初步探明不同極性酚類物質的抗氧化能力和清除自由基的效果，有利于有針對性地分離、提取活性物質。在發現油茶籽中含有中等極性的抗氧化活性成分的基礎上，進一步研究亞臨界茶油的抗氧化活性，從而為論證亞臨界茶油的高品質奠定基礎。

2 材料與方法

2.1 材料與設備

油茶籽；油茶籽醇提物：自制（油茶籽經挑選后熱風干燥，用70%乙醇，在35 ℃下提取30 min，料液比1∶30，減壓濃縮真空干燥，密閉、低溫保存備用）；市售茶油、亞臨界茶油，參數選擇：原料堆密度0.7 kg/L，萃取時間70 min，萃取壓力0.5 MPa，萃取溫度45 ℃，顆粒度10目，亞臨界丁烷；沒食子酸（GA）標準品；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼；三氯乙酸。

鼓風干燥箱，旋轉蒸發儀，真空泵，超聲清洗器，、數顯恒溫水浴箱，棱光紫外分光光度計，中藥粉碎機。

2.2 實驗方法

（1）油茶籽醇提物的分級萃取。稱取一定量的油茶籽醇提物，用水配制成懸浮液，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分別萃取3次。各不同極性的萃取液合并后用旋轉蒸發儀減壓濃縮至干粉，即得到分級萃取各相，分別為石油醚相、乙酸乙酯相，正丁醇相及水分級相。

（2）油茶籽醇提物及其各分級萃取相的總酚含量測定。標準曲線的制定：準確稱取真空干燥至恒重的沒食子酸標準品44.3 mg，用水溶解并定容至100 mL。以此溶液配成濃度為8.86、17.72、35.44、70.88 μg/mL和88.60 μg/mL的溶液。分別取上述不同溶液1 mL加到10 mL比色管中，依次加入1 mL去離子水，0.5 mL已稀釋2倍的福林-酚試液，1.5 mL 26.7%Na2CO3溶液，最后用水定容至10 mL，室溫下反應2 h，在760 nm下測定其吸光度。由吸光度對濃度進行回歸分析，繪制標準曲線。試樣的測定：準確稱取適量試樣，用水溶解，濃度在0.08 mg/mL左右。取1 mL樣品液加到10 mL比色管中，測得的吸光度代入標準曲線，求得試樣中總多酚的含量。

（3）清除DPPH自由基活性的測定。試樣的測定：分別將各相萃取物提取液4 mL和2×10-4mol/L DPPH溶液1 mL加入同一具塞試管中搖勻，在室溫下密閉靜置30 min，用純溶劑甲醇作參比液，于517 nm波長下測定吸光度。根據公式（1）計算每種提取液對DPPH自由基的清除率。

其中，As為加4 mL提取液后DPPH溶液的吸光度；Asb為4 mL提取液+1 mL溶劑（甲醇）后的吸光度；Ac為4 mL溶劑（甲醇）+1 mLDPPH溶液的吸光度。

（4）還原能力的測定。在2.5 mL pH=6.6的磷酸鹽緩沖液中加入不同濃度的試樣液2.5 mL，1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合物在50 ℃恒溫20 min后，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，然后以3 000 r/min離心分離10 min，取上層清液5 mL加蒸餾水5 mL和0.1% FeC13溶液l mL，在700nm處測定吸光度，即為OD值。吸光度越高，還原能力越強。

3 結果與分析

3.1 油茶籽醇提物不同萃取層中總酚含量

以標準沒食子酸濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標，繪制標準曲線，用最小二乘法進行線性回歸分析得標準回歸方程為y=0.007 9x+0.045 6，線性相關系數R2=0.9961。利用沒食子酸濃度與吸光值的關系標準曲線圖，可根據吸光值推測定試樣的沒食子酸濃度。在堿性溶液中，顏色的深淺與多酚含量呈正相關，藍色化合物在760 nm處有最大吸收。一般用沒食子酸（或焦性沒食子酸）作為參照標準。提取物中總多酚的含量以等同于沒食子酸的量表示。

取各不同極性的干粉，配置成相同濃度，利用沒食子酸標準曲線測定其中總酚含量，總酚含量大小依次為：正丁醇＞乙酸乙酯＞水層＞石油醚層。

3.2 油茶籽醇提取物不同萃取層清除DPPH自由基活性

相同濃度下，不同萃取層清除DPPH自由基活性的能力不同，自由基清除能力大小依次為：乙酸乙酯＞正丁醇＞水層＞石油醚層。在所測濃度內，乙酸乙酯層表現出較強的自由基清除能力。

3.3 油茶籽醇提取物不同萃取層還原能力

各萃取層樣品反應后的生成物在700 nm下的吸光度大小，可反映出物質抗氧化能力的強弱。OD值由大到小依次為：乙酸乙酯＞正丁醇＞水層＞石油醚層。結合以上三點可知，油茶籽醇提取物中不同萃取層的還原能力、DPPH清除率與酚類含量呈正相關關系。

3.4 乙酸乙酯層柱層析后抗氧化活性比較

取乙酸乙酯層萃取物，過100～200目硅膠柱，以乙酸乙酯∶甲醇進行梯度洗脫，洗脫比例分別為：10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4和5∶5（極性依次增加）。每個梯度洗脫3倍柱體積，分段收集，以自由基清除率和還原能力為評價指標進行檢測。以自由基的清除率為比較指標得出：6∶4＞9∶1＞油茶籽醇提取物＞10∶0＞7∶3＞8∶2＞5∶5。以還原能力為比較指標：9∶1＞油茶籽醇提取物＞6∶4＞10∶0＞7∶3＞5∶5＞8∶2。結果進一步論證了油茶籽中抗氧化成分的存在及其極性大小。

3.5 亞臨界茶油與市售茶油的自由基清除能力比較

市售茶油和亞臨界茶油均有清除DPPH自由基的能力，且清除能力與樣品的濃度呈現正相關關系，隨著樣品濃度的增大其清除能力也越大。但隨著濃度的增加，亞臨界茶油的自由基清除能力明顯高于市售茶油，這可能與其含有較多的有效抗氧化成分有關。

4 結語

油茶籽中含有抗氧化活性成分。利用活性跟蹤方法發現，對油茶籽醇提取物進行分級萃取，其活性較強的部分集中在乙酸乙酯層，過柱后活性部位主要富集在9∶1和6∶4，且初步研究得出亞臨界茶油的自由基清除率優于市售精煉茶油。

參考文獻：

[1]毛方華，王鴻飛，劉 飛等.茶籽油的提取及其對自由基清除作用的研究[J].西北林學院學報，2009（5）：125-128.

[2]董新榮，劉宇光，李本祥.芝麻酚對茶油抗氧化活性研究[J].食品研究與開發，2008（7）：19-21.

[3]李川山，陳 曄.植物精油提取工藝研究進展[J].大眾科技，2010（9）：86-87.