提取油茶籽抗氧化活性物質(zhì)的研究

◎ 曾麗珠，李 軒，張 昊

（陽(yáng)江出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 陽(yáng)江 529500）

1 研究背景

1.1 油茶籽的應(yīng)用價(jià)值

油茶（Camellia oleiferaAbel）隸屬于山茶科（Theacese）山茶屬（CamelliaL），是我國(guó)特有的食用油料樹(shù)種，脂肪酸組成與在西方被譽(yù)為“液體黃金”的橄欖油相似，長(zhǎng)期食用茶油，具有預(yù)防心腦血管疾病、抗肝炎、抗衰老、防癌抗癌等功效。而油茶籽油具有多種功效，歸功于其含有多種功能性成分，如角鯊烯、茶多酚、山茶皂甙、山茶甙等活性物質(zhì)[1]。

目前，國(guó)內(nèi)外使用較多的是合成抗氧化劑，如沒(méi)食子酸丙酯（PG）、二叔丁基羥基甲苯（BHT）、叔丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）或丁基羥基茴香醚（BTA）等[2]，但隨著人們食品安全意識(shí)的提高，對(duì)合成添加劑的添加提出了質(zhì)疑。從油茶籽中提取出高效安全低毒的抗氧化活性物質(zhì)，成為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)天然高效食品抗氧化劑的重要途徑。

1.2 亞臨界萃取技術(shù)的應(yīng)用

傳統(tǒng)的油茶籽油的提取工藝主要有壓榨法、有機(jī)溶劑浸提法、水蒸氣蒸餾法、油脂分離法等，新型的提取工藝則有超臨界萃取法[3]和亞臨界萃取，顯然前幾種的提取方法都會(huì)一定程度上影響茶油的成率和品質(zhì)，超臨界CO2提取茶籽油盡管產(chǎn)品質(zhì)量好、得率高，但設(shè)備要求高，一次性資金投入較大。而亞臨界萃取作為其中一種新型提取工藝，有著條件相對(duì)溫和，對(duì)高壓設(shè)備要求不苛刻和成本更低的優(yōu)點(diǎn)。

1.3 研究的目的與意義

本文通過(guò)提取油茶籽中不同極性物質(zhì)，對(duì)不同極性的萃取物質(zhì)進(jìn)行總酚含量的測(cè)定，并利用油茶籽油中不同極性萃取物進(jìn)行自由基清除能力試驗(yàn)，初步探明不同極性酚類物質(zhì)的抗氧化能力和清除自由基的效果，有利于有針對(duì)性地分離、提取活性物質(zhì)。在發(fā)現(xiàn)油茶籽中含有中等極性的抗氧化活性成分的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究亞臨界茶油的抗氧化活性，從而為論證亞臨界茶油的高品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 材料與設(shè)備

油茶籽；油茶籽醇提物：自制（油茶籽經(jīng)挑選后熱風(fēng)干燥，用70%乙醇，在35 ℃下提取30 min，料液比1∶30，減壓濃縮真空干燥，密閉、低溫保存?zhèn)溆茫皇惺鄄栌汀喤R界茶油，參數(shù)選擇：原料堆密度0.7 kg/L，萃取時(shí)間70 min，萃取壓力0.5 MPa，萃取溫度45 ℃，顆粒度10目，亞臨界丁烷；沒(méi)食子酸（GA）標(biāo)準(zhǔn)品；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼；三氯乙酸。

鼓風(fēng)干燥箱，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，真空泵，超聲清洗器，、數(shù)顯恒溫水浴箱，棱光紫外分光光度計(jì)，中藥粉碎機(jī)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）油茶籽醇提物的分級(jí)萃取。稱取一定量的油茶籽醇提物，用水配制成懸浮液，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分別萃取3次。各不同極性的萃取液合并后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干粉，即得到分級(jí)萃取各相，分別為石油醚相、乙酸乙酯相，正丁醇相及水分級(jí)相。

（2）油茶籽醇提物及其各分級(jí)萃取相的總酚含量測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：準(zhǔn)確稱取真空干燥至恒重的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品44.3 mg，用水溶解并定容至100 mL。以此溶液配成濃度為8.86、17.72、35.44、70.88 μg/mL和88.60 μg/mL的溶液。分別取上述不同溶液1 mL加到10 mL比色管中，依次加入1 mL去離子水，0.5 mL已稀釋2倍的福林-酚試液，1.5 mL 26.7%Na2CO3溶液，最后用水定容至10 mL，室溫下反應(yīng)2 h，在760 nm下測(cè)定其吸光度。由吸光度對(duì)濃度進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試樣的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取適量試樣，用水溶解，濃度在0.08 mg/mL左右。取1 mL樣品液加到10 mL比色管中，測(cè)得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得試樣中總多酚的含量。

（3）清除DPPH自由基活性的測(cè)定。試樣的測(cè)定：分別將各相萃取物提取液4 mL和2×10-4mol/L DPPH溶液1 mL加入同一具塞試管中搖勻，在室溫下密閉靜置30 min，用純?nèi)軇┘状甲鲄⒈纫海?17 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。根據(jù)公式（1）計(jì)算每種提取液對(duì)DPPH自由基的清除率。

其中，As為加4 mL提取液后DPPH溶液的吸光度；Asb為4 mL提取液+1 mL溶劑（甲醇）后的吸光度；Ac為4 mL溶劑（甲醇）+1 mLDPPH溶液的吸光度。

（4）還原能力的測(cè)定。在2.5 mL pH=6.6的磷酸鹽緩沖液中加入不同濃度的試樣液2.5 mL，1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合物在50 ℃恒溫20 min后，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，然后以3 000 r/min離心分離10 min，取上層清液5 mL加蒸餾水5 mL和0.1% FeC13溶液l mL，在700nm處測(cè)定吸光度，即為OD值。吸光度越高，還原能力越強(qiáng)。

3 結(jié)果與分析

3.1 油茶籽醇提物不同萃取層中總酚含量

以標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)食子酸濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為y=0.007 9x+0.045 6，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9961。利用沒(méi)食子酸濃度與吸光值的關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，可根據(jù)吸光值推測(cè)定試樣的沒(méi)食子酸濃度。在堿性溶液中，顏色的深淺與多酚含量呈正相關(guān)，藍(lán)色化合物在760 nm處有最大吸收。一般用沒(méi)食子酸（或焦性沒(méi)食子酸）作為參照標(biāo)準(zhǔn)。提取物中總多酚的含量以等同于沒(méi)食子酸的量表示。

取各不同極性的干粉，配置成相同濃度，利用沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定其中總酚含量，總酚含量大小依次為：正丁醇＞乙酸乙酯＞水層＞石油醚層。

3.2 油茶籽醇提取物不同萃取層清除DPPH自由基活性

相同濃度下，不同萃取層清除DPPH自由基活性的能力不同，自由基清除能力大小依次為：乙酸乙酯＞正丁醇＞水層＞石油醚層。在所測(cè)濃度內(nèi)，乙酸乙酯層表現(xiàn)出較強(qiáng)的自由基清除能力。

3.3 油茶籽醇提取物不同萃取層還原能力

各萃取層樣品反應(yīng)后的生成物在700 nm下的吸光度大小，可反映出物質(zhì)抗氧化能力的強(qiáng)弱。OD值由大到小依次為：乙酸乙酯＞正丁醇＞水層＞石油醚層。結(jié)合以上三點(diǎn)可知，油茶籽醇提取物中不同萃取層的還原能力、DPPH清除率與酚類含量呈正相關(guān)關(guān)系。

3.4 乙酸乙酯層柱層析后抗氧化活性比較

取乙酸乙酯層萃取物，過(guò)100～200目硅膠柱，以乙酸乙酯∶甲醇進(jìn)行梯度洗脫，洗脫比例分別為：10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4和5∶5（極性依次增加）。每個(gè)梯度洗脫3倍柱體積，分段收集，以自由基清除率和還原能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。以自由基的清除率為比較指標(biāo)得出：6∶4＞9∶1＞油茶籽醇提取物＞10∶0＞7∶3＞8∶2＞5∶5。以還原能力為比較指標(biāo)：9∶1＞油茶籽醇提取物＞6∶4＞10∶0＞7∶3＞5∶5＞8∶2。結(jié)果進(jìn)一步論證了油茶籽中抗氧化成分的存在及其極性大小。

3.5 亞臨界茶油與市售茶油的自由基清除能力比較

市售茶油和亞臨界茶油均有清除DPPH自由基的能力，且清除能力與樣品的濃度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，隨著樣品濃度的增大其清除能力也越大。但隨著濃度的增加，亞臨界茶油的自由基清除能力明顯高于市售茶油，這可能與其含有較多的有效抗氧化成分有關(guān)。

4 結(jié)語(yǔ)

油茶籽中含有抗氧化活性成分。利用活性跟蹤方法發(fā)現(xiàn)，對(duì)油茶籽醇提取物進(jìn)行分級(jí)萃取，其活性較強(qiáng)的部分集中在乙酸乙酯層，過(guò)柱后活性部位主要富集在9∶1和6∶4，且初步研究得出亞臨界茶油的自由基清除率優(yōu)于市售精煉茶油。

參考文獻(xiàn)：

[1]毛方華，王鴻飛，劉 飛等.茶籽油的提取及其對(duì)自由基清除作用的研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2009（5）：125-128.

[2]董新榮，劉宇光，李本祥.芝麻酚對(duì)茶油抗氧化活性研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2008（7）：19-21.

[3]李川山，陳 曄.植物精油提取工藝研究進(jìn)展[J].大眾科技，2010（9）：86-87.