響應面法優化超聲波輔助提取冬蟲夏草多糖工藝研究

◎ 劉忠宇，杜 靜，王 瑜

（1.貴州省貞豐縣市場監督檢測所，貴州 貞豐 562200；2.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550002)

隨著分子生物學的發展，多糖多種多樣的生物活性被揭示，且有些多糖已在功能食品及臨床上廣泛使用，這也使多糖生物資源的開發利用和研究日益活躍，成為天然藥物、食品科學、生物化學及生命科舉的研究熱點[1]。冬蟲夏草為麥角菌科真菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲蟲草蝙蝠蛾幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體，我國絕大多數學者和人們所指的冬蟲夏草，是特指僅分布于我國青藏高原及邊緣地區高寒草甸的中華蟲草菌，寄生于蝙蝠蛾屬、蟲草蝙蝠蛾或綠蝙蝠蛾的幼蟲，感病后形成的蟲菌復合體其他類群僅稱為蟲草，不是地道的冬蟲夏草[2]。其性平，味甘，具補肺益腎、止血化痰之功效，可增強機體對病毒及寄生蟲的抵抗力[3]。多糖是冬蟲夏草的主要活性成分之一[4]，具有抗腫瘤、增強機體免疫力和降血糖多方面藥理作用。冬蟲夏草主要含有冬蟲夏草素、蟲草酸、腺苷和多糖等成分，由于其天然蟲草素含量較高，因此抗癌效果更為顯著[5]；對人體的內分泌系統和神經系統有良好的調節作用；蟲草酸能改變人體微循環，具有明顯的降血脂和鎮咳祛痰作用；蟲草多糖是免疫調節劑，可增強機體對病毒及寄生蟲的抵抗力[6]。由于多糖結構復雜，許久以來，人們對多糖的認識僅限于其是生物體內的能量資源和結構材料[7]，多糖的常用提取方法主要有水提法[8]、弱酸提取法、弱堿提取法、酶提法、超聲輔助提取法[9]、微波輔助提取法及超臨界流體萃取法等。超聲波提取法是應用越聲波強化攝取植物有效成分的方法[10]，是一種物理破碎過程。超聲波是頻率在20 kHz以上的聲波，對煤質主要產生獨特的空化作用[11]。與常規提取法相比，超聲波提取有利于縮短時間，提高提取效率，所以超聲提取在植物有效成分的提取中得到廣泛應用[12]。實驗采用超聲波輔助法提取冬蟲夏草多糖，設計響應面實驗優化工藝參數，為冬蟲夏草多糖的產業化開發提供一定的理論依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

冬蟲夏草樣品，采自華東藥業有限公司；葡萄糖、苯酚、濃硫酸、95%乙醇和無水乙醇等化學試劑均為國產分析純；試驗用水均為蒸餾水。

1.2 實驗儀器

101型電熱鼓風干燥箱，北京市光明醫藥儀器廠；BS124S電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；T6新世紀紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；TDL8M臺式低速冷凍離心機，長沙高新開發區湘儀貝克儀器儀表有限公司；中草藥粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-300DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

2 實驗方法

2.1 冬蟲夏草多糖含量的測定

2.1.1 標準曲線的繪制

精密量取葡萄糖標準溶液0.00、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80 mL和1.00 mL，分別置于具塞試管中，加蒸餾水至2 mL，再分別加入5%苯酚1 mL，搖勻后，迅速加入5 mL濃硫酸，混勻，各管加完后一起浸于水浴溫度40 ℃的恒溫水浴鍋中，管口加蓋玻璃球，以防揮發，加熱15 min。取出，自來水冷卻10 min，以蒸餾水的反應液體作為空白。用分光光度計在波長490 nm處測定吸光度，繪制葡萄糖標準曲線，得出吸光度（A）對葡萄糖濃度（C）進行線性回歸方程。

2.1.2 提取率測定方法

冬蟲夏草樣品經過75 ℃烘干后，用粉碎機粉碎過100目的篩子，制得冬蟲夏草粉末，精確稱取1 g粉末，按照一定的料液比，添加蒸餾水，在不同溫度、不同功率的超聲波條件下提取一段時間后，提取液經4 000 r/min離心10 min，取上清液作為多糖提取液。精密吸取樣品多糖提取液2 mL，置于10 mL比色管中。加入苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加硫酸5 mL，搖勻，放置15 min，于490 nm處測吸光度。根據吸光度（A）對葡萄糖濃度（C）線性回歸方程計算多糖含量[13]。提取率的計算公式如下：

式（1）中，C為冬蟲夏草多糖含量濃度，g/L；M為冬蟲夏草粉末質量，g。

2.2 提取率影響因素單因素實驗設計

2.2.1 冬蟲夏草多糖提取超聲波功率的選擇

精確稱取冬蟲夏草粉末1 g，添加50 mL蒸餾水，提取溫度設定為40 ℃，分別在功率120、150、180、240 W和300 W的超聲波條件下提取20 min，然后提取液經4 000 r/min離心10 min，取上清液作為多糖提取液。精密吸取樣品多糖提取液2 mL，置于10 mL比色管中。加入苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加硫酸5 mL，搖勻，放置15 min，于490 nm處測定吸光度，根據公式計算提取率。

2.2.2 冬蟲夏草多糖提取時間的選擇

精確稱取冬蟲夏草粉末1 g，添加50 mL蒸餾水，提取溫度設定為40 ℃，在功率300 W的超聲波條件下提取15、20、25、30、35 min和40 min，然后提取液經4 000 r/min離心10 min，取上清液作為多糖提取液。精密吸取樣品多糖提取液2 mL，置于10 mL比色管中。加入苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加硫酸5 mL，搖勻，放置15 min，于490 nm處測定吸光度，根據公式計算提取率。

2.2.3 冬蟲夏草多糖提取溫度的選擇

精確稱取冬蟲夏草粉末1 g，添加50 mL蒸餾水，提取溫度分別為25、35、45、55 ℃和65 ℃，在超聲波為功率300 W的條件下提取20 min。然后提取液經4 000 r/min離心10 min，取上清液作為多糖提取液。精密吸取樣品多糖提取液2 mL，置于10 mL比色管中。加入苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加硫酸5 mL，搖勻，放置15 min，于490 nm處測定吸光度，根據公式計算提取率。

2.2.4 冬蟲夏草多糖提取料液比的選擇

精確稱取冬蟲夏草粉末1 g，料液比為1/40、1/50、1/60、1/70和1/80，提取溫度為40 ℃，超聲波為功率300 W的條件下提取20 min。然后提取液經4 000 r/min離心10 min，取上清液作為多糖提取液。精密吸取樣品多糖提取液2 mL，置于10 mL比色管中。加入苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加硫酸5 mL，搖勻，放置15 min，于490 nm處測定吸光度，根據公式計算提取率。

2.3 響應面提取優化實驗設計

為了進一步研究超聲波功率、提取時間、提取溫度、料液比對冬蟲夏草多糖提取工藝的影響，考慮其交互作用并確定最佳工藝條參數，設計響應面優化實驗，選取超聲波功率、提取時間、提取溫度、料液比為變量，提取率為響應值。對工藝參數進行優化，響應面設計因素水平表如表1所示。

表1 響應面試驗設計因素水平表

3 結果與分析

3.1 葡萄糖標準曲線的制定

取濃度為10、20、30、40、60 g/L和80 g/L葡萄糖標準溶液繪制標準曲線如圖1所示，橫坐標為多葡萄糖水溶液的濃度C（g/L），縱坐標為吸光度值。對數據進行回歸分析得到回歸方程：

A=0.008 6C＋0.010 6，相關系數R2=0.998 8，則根據提取率計算公式可知：

式（2）中，A為吸光度；M為冬蟲夏草粉末質量，g。

圖1 葡萄糖標準曲線圖

3.2 單因素實驗結果分析

3.2.1 超聲波功率對多糖提取率的影響

超聲波功率對多糖提取率的影響結果見圖2。

圖2 超聲波功率對多糖提取率的影響圖

從圖2可知，隨著超聲波功率的增加，冬蟲夏草多糖的提取率逐漸增大，超聲波功率達到240 W時，提取率達到最大值，以后隨著超聲功率的增加提取率變化較小?？紤]到經濟效益以及超聲波功率過高使多糖降解，降低多糖活性等因素，因此選擇超聲波功率以240 W為宜。

3.2.2 提取時間對多糖提取率的影響

提取時間對多糖提取率的影響結果見圖3。

圖3 提取時間對多糖提取率的影響圖

從圖3可知，隨著提取時間的不斷增加，在15～30 min內，冬蟲夏草多糖的提取率逐漸增大；當提取時間超過30 min時，在30～40 min內，多糖的提取率趨于平緩，略有下降。這可能是由于超聲具有較強的機械切割作用，長時間的作用會破壞多糖，在后處理過程中損失增大而影響多糖的提出率，造成負面影響，表明提取時間不宜過長，控制在30 min左右為宜。

3.2.3 提取溫度對多糖提取率的影響

提取溫度對多糖提取率的影響結果見圖4。

圖4 提取溫度對多糖提取率的影響圖

從圖4可知，隨著提取溫度的不斷升高，在35 ℃時，冬蟲夏草多糖的提取率達到最大值，當提取溫度超過35 ℃時，35～45 ℃趨于平緩，然后隨著溫度的升高，多糖的提取率逐漸下降。這可能是由于較高的溫度對冬蟲夏草的活性多糖有破壞作用。另外，有研究表明溫度過高會影響到冬蟲夏草的藥理活性，為了保證其活性不被破壞，應選擇35 ℃作為冬蟲夏草多糖適宜的提取溫度。

3.2.4 料液比對多糖提取率的影響

料液比對多糖提取率的影響結果見圖5。

圖5 料液比對多糖提取率的影響圖

從圖5可知，料液比對冬蟲夏草多糖的提取率影響不是很大，在料液比為1/50時，出現峰值，較其他料液比而言，提取率較大，隨著料液比的不斷增大，提取率略有下降。因此，選擇1/50的料液比，作為冬蟲夏草多糖的提取適宜料液比。

3.3 響應面優化提取工藝結果分析

3.3.1 響應面實驗結果

在單因素實驗的基礎上，選取超聲波功率X1、提取時間X2、提取溫度X3、料液比X4為變量，提取率為響應值，進行相應面分析實驗，實驗結果見表2。

表2 響應面設計方案及實驗結果表

響應面二次回歸模型方差分析結果見表3。

表3 響應面二次回歸模型方差分析表

由表3可知，回歸模型顯著，其中一次項超聲波功率X1極顯著，提取時間X2顯著，提取溫度X3和料液比X4不顯著；X1X2極顯著，X1X3、X1X4、X2X3、X2X4和X3X4之間的交互作用不顯著；二次項X21X22、X32、X42都是極顯著的，因此各個具體試驗因子與響應值都不是簡單的線性關系。多糖提取率所建的回歸模型P＜0.01是極顯著的，并且該回歸模型的R2=0.969 6，模型與實際試驗失擬項P=0.050 8不顯著，說明試驗擬合較好，試驗誤差小，可用該回歸方程代替試驗真實點對冬蟲夏草多糖提取率進行分析和預測。

3.3.2 響應面擬合方程的建立

采用Design-Expert8.0程序對表4.2 中所得數據進行回歸分析，各因素經過回歸擬合后，解得回歸方程如下：

3.3.3 各因素交互作用對多糖提取率的影響

各因素交互作用對多糖提取率的影響結果分別見圖 6～11。

圖6 超聲波功率和提取時間交互作用圖

圖7 超聲波功率和提取溫度交互作用圖

圖8 超聲波功率和料液比交互作用圖

圖9 提取溫度和提取時間交互作用圖

圖10 料液比和提取時間交互作用圖

圖11 料液比和提取溫度交互作用圖

由圖6～11可知，超聲波功率和提取時間對冬蟲夏草多糖提取率的影響最為顯著，表現為曲線較陡；提取溫度和超聲波功率次之，表現為曲線稍為平滑，隨其數值的增加或減少，響應值變化較小。通過軟件分析，多糖提取的最佳條件為：超聲波功率300 W，提取時間29.85 min，提取溫度45.96 ℃，料液比1/49.94。在此條件下多糖提取率的理論值為14.52%。為了方便實際操作，將條件修正為超聲波功率300 W，提取時間30 min，提取溫度45 ℃，料液比為1/50。在此條件下測得多糖的提取率為13.48%，即與理論預測值的誤差為1.04%，說明理論值與實際值基本相符，采用響應曲面法優化得到的超聲波提取條件參數，具有一定的實用價值。

4 結論

本文在單因素實驗的基礎上，設計響應面優化實驗對冬蟲夏草多糖的超聲輔助提取法進行優化，最終得出模型較好的回歸方程：Y=+11.29-5.01X1-0.71X2+0.38X3+0.055X4-0.65X1X2+0.13X1X3+0.058X1X4+0.23X2X3+0.14X2X4-0.040X3X4-1.79X12-0.60X22-1.30X32-1.20X42。最終確定超聲波輔助提取冬蟲夏草多糖工藝參數為：超聲波功率300 W，提取時間30 min，提取溫度45 ℃，料液比1/50。在此參數下冬蟲夏草多糖提取率最大。該工藝參數對冬蟲夏草多糖的超聲波提取具有一定的參考意義。

參考文獻：

[1]程 超，李 偉.幾種植物水溶性多糖的體外抗氧化作用[J].食品工業科技，2006，27（9）：63-65.

[2]宋江峰，劉春泉，李大婧，等.北冬蟲夏草多糖活性研究進展[J].江蘇農業科學，2006，34（4）：145-148.

[3]潘夢舒.冬蟲夏草及雷公藤多甙對糖尿病腎病大鼠足細胞影響的實驗研究[D].合肥：安徽醫科大學，2012.

[4]許燕燕.植物多糖的提取方法和工藝[J].福建水產，2006，35（2）：32-36.

[5]劉桂萍.冬蟲夏草多糖測定方法的研究進展[J].藥學實踐雜志，2008，26（1）：53-54.

[6]董彩虹.冬蟲夏草多糖的研究進展[J].食品科學，2004，25（7）：195-198.

[7]朱曉霞，羅學剛.多糖提取與純化技術應用進展[J].食品研究與開發，2007，28（3）：186-189.

[8]高 峰，于亞莉，劉靜波，等.水法提取北冬蟲夏草多糖的工藝研究[J].食品科技，2010，36（8）：213-216.

[9]胡斌杰，陳金鋒，王宮南.超聲波法與傳統熱水法提取靈芝多糖的比較研究[J].食品工業科技，2007，29（2）：190-192.

[10]尹 艷，高文宏，于淑娟.多糖提取技術的研究進展[J].食品工業科技，2007，29（2）：248-250.

[11]秦秀麗，李鳳林.超聲波法提取蛹蟲草多糖的工藝研究[J].江蘇農業科學，2011，39（5）：378-380.

[12]李堅斌，李 琳，李 冰，等.超聲降解多糖研究進展[J].食品工業科技，2006，28（9）：181-184.

[13]王安亭，王 祖.冬蟲夏草蟲草多糖的分離純化及含量的測定[J].食用菌，2012，34（1）：60-62.