金銀花葉中綠原酸的純化工藝研究

唐蕾

江蘇省中醫院 江蘇南京 210029

金銀花葉中綠原酸的純化工藝研究

唐蕾

江蘇省中醫院 江蘇南京 210029

目的探索金銀花葉中綠原酸的純化工藝，使提取物中綠原酸含量在 80%以上。方法運用正交試驗法設計洗脫條件，采用Minitab軟件分析正交試驗結果，并對萃取工藝參數進行了研究。結果1O倍量的75%的乙醇回流提取金銀花葉2次，每次1.5h，過濾，濃縮至無醇味，調節pH至2.5，以16mL/min速度上樣，1倍柱體積純水沖洗，再以10%的乙醇10個柱體積以10～15 mL/min的流速洗脫，洗脫液濃縮至藥材：藥液＝2:1的濃度，用等量乙酸乙酯萃取8次，合并萃取液后濃縮干燥，所得提取物中綠原酸含量達90%以上，綠原酸的轉移率77%左右。結論該法所得提取物綠原酸含量80%以上，可作為開發5類新藥的原料。

金銀花葉；綠原酸；提取純化；大孔樹脂；萃取

金銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或帶初開的花，功能主治：清熱解毒，疏散風熱。用于癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風熱感冒，溫病發熱[1]。金銀花中綠原酸類成分為金銀花的抗菌有效成分，因而綠原酸的含量高低為評價金銀花優劣的標準[2]。也有文獻報道其葉中亦含有豐富的綠原酸，其含量略低于花，但總黃酮含量稍高，且葉的產量大、資源豐富[3]，因而本文以金銀花葉為原料、綠原酸為指標考察提取純化工藝，使得提取物中綠原酸的含量在80%以上，可作為5類新藥開發。

1.材料與方法

1.1 材料

金銀花葉（產地：山東平邑，藥典方法測定綠原酸含量2.45%）批號為 140601，綠原酸對照品（購自中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號:110753-200413），乙腈為色譜純，磷酸、乙酸乙酯為分析純，乙醇為食用級，D101樹脂。島津高效液相色譜儀，DAD檢測器，BUCHI旋轉蒸發儀，梅特勒電子分析天平。

1.2 方法

1.2.1 金銀花葉中綠原酸的含量測定

色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈—0.4%磷酸溶液（13：87）為流動相；柱溫：25℃；檢測波長：327nm。理論塔板數按綠原酸峰計算不低于1000。

對照品溶液：精密稱取綠原酸對照品適量，置棕色量瓶中，以50%甲醇制成每1mL含40μg的溶液，即得（10℃以下保存）。

供試品溶液：取金銀花葉粉末（過四號篩）約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇50mL，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率35kHz)30分鐘，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5mL，置25mL棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得。

樣品測定：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL注入液相色譜儀，測定，即 得。

1.2.2 金銀花葉中綠原酸的提取

綠原酸、異綠原酸在水和乙醇中的溶解性都比較好，文獻報告金銀花葉中醇提的成分對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有抑菌效果[4]。醇浸水提法提取金銀花葉中的綠原酸得率為6.86%[5]。武達等[6]比較了傳統水煎法、乙醇回流法、超聲提取法對金銀花中綠原酸提取率的影響，結果1O倍量的75%的乙醇回流提取2次，每次1.5h的工藝綠原酸提取率最高。

我們選擇武達等報道的工藝，并進行驗證：稱取干燥的金銀花葉3kg，平均分成三份，每份用1O倍量的75%的乙醇回流提取1.5h，過濾，再加入1O倍量的75%的乙醇回流提取1.5h兩次，過濾，合并濾液，得提取液。取上述提取液（相當于生藥材量0.5g），置蒸發皿中，50℃水浴蒸干，殘渣用50%甲醇充分溶解并定容至100mL，搖勻，過濾，得供試品溶液。按照1.2.1中方法測定提取液中綠原酸含量，計算綠原酸轉移率。

1.2.3 金銀花葉提取液中綠原酸的純化工藝

文獻報道提取溶液調至酸性，上D101樹脂后水洗，再收集醇洗溶液，濃縮后乙酸乙酯萃取的方法可富集綠原酸[7-8]。根據文獻上樣液的pH控制在2-3之間，最佳2.5，因而上樣前應調提取液pH至2.5，并進一步考察其他參數。

稱取金銀花葉2kg按照1.2.1中的方法提取，所得提取液濃縮至無醇味，調提取液pH至2.5，置冰箱中待用。

1.2.3.1 樹脂用量的考察

D-101大孔樹脂100g，裝于長50cm，直徑3cm的玻璃柱中，共 4根，水洗好，備用。分別取相當于含 20g，40g，60g，80g生藥材的提取液以2mL/min流速上樣。再加一倍柱體積水洗，合并上樣殘液和水洗液，待用。吸取上述溶液各 50mL，置蒸發皿中，50℃水浴蒸干，殘渣加50%甲醇充分溶解并定容至10mL，搖勻，過濾，按照1.2.1中方法測定溶液中綠原酸的量。

1.2.3.2 上樣水洗速度考察

稱取D-101大孔樹脂100g，裝柱，柱長50cm，直徑3cm，平行4根，水洗好，備用。分別取1.2.2制備的濃縮液四份，每份相當于生藥材40g，分別以8、12、16和20mL/min的速度上樣，上樣完畢后加一倍柱體積水洗，合并上樣殘液和水洗液，待用。精密吸取上述溶液各 10mL，置蒸發皿中，50℃水浴蒸干，殘渣加50%甲醇充分溶解并定容至10mL，搖勻，過濾，按照1.2.1中方法測定溶液中綠原酸的量。

1.2.3.3 洗脫條件的選擇

文獻報道，堿性去離子水或低濃度的乙醇溶液可用于綠原酸的洗脫[9]，因而本文選用低濃度的乙醇作為洗脫溶劑。以乙醇的濃度A、洗脫速度B 以及洗脫體積C為因素，各選三個水平，以L9（34）進行正交試驗，因素水平表見表1。

表1 因素水平表

稱取D-101大孔樹脂100g，裝柱，柱長50cm，直徑3cm，平行9根，水洗好，備用。分別取1.2.2制備的濃縮液9份，每份相當于生藥材40g，按照表4的試驗安排用A濃度的乙醇C柱體積以B流速洗脫，收集洗脫液。吸取洗脫液1mL，置蒸發皿中，50℃水浴蒸干，殘渣加50%甲醇充分溶解并定容至10mL，搖勻，過濾，按照1.2.1中方法測定溶液中綠原酸的量，計算綠原酸的轉移率。

運用Minitab軟件對試驗結果進行分析，確定最佳工藝。

1.2.3.4 洗脫工藝驗證

稱取D-101大孔樹脂100g，裝柱，柱長50cm，直徑3cm，平行3根，水洗好，備用。取1.2.2制備的濃縮液3份，按照最佳洗脫工藝10%的乙醇10個柱體積以10-15 mL/min的流速洗脫，收集洗脫液，按照 1.2.1中方法測定溶液中綠原酸的量，計算綠原酸的轉移率。

1.2.3.5 萃取工藝參數確定

經洗脫后提取物的綠原酸轉移率達88%左右，但綠原酸含量未達到80%，文獻報道[10]可用石油醚、乙酸乙酯萃取的方式提純綠原酸。本文選擇乙酸乙酯最為萃取溶劑。取2.4kg金銀花葉，按照優選的工藝提取純化，得洗脫液。將洗脫液平均分成6份，其中3份分別濃縮至藥材：藥液＝2:1，4:1，6:1，等量乙酸乙酯萃取10次，合并每2次乙酸乙酯液。按照1.2.1中方法測定每份萃取溶液中綠原酸的量，計算綠原酸的轉移率。

剩余3份按照最佳的萃取后，濃縮、干燥，得提取物，測定提取物中綠原酸的轉移率及含量。

2.結果

2.1 金銀花葉中綠原酸的提取

結果3次平行試驗中綠原酸的轉移率分別為91.92%、90.33%和92.82%，平均值為91.69%。

2.2 樹脂用量的考察

結果四根樹脂柱吸附綠原酸的量分別為0.49、0.98、1.42和1.43g， 表明100g D-101樹脂可吸附綠原酸的量為1.4g，即綠原酸與樹脂的比為1.4：100，為防止大生產中綠原酸的損失，綠原酸與大孔樹脂的比選擇1：100，即40g綠原酸含量為2.45%的金銀花葉提取得到的藥液需用D-101樹脂約100g。

2.3 上樣水洗速度考察結果

結果表明，上樣速度為8、12、16 mL/min時，綠原酸能被完全吸收，當速度達到20mL/min時綠原酸不能被完全吸收，因而上樣速度選擇16 mL/min。

2.4 洗脫條件優選結果

結果見表2正交試驗結果表、表3均值相應表。

表2 正交試驗結果

表3 均值響應表

由結果可知，最佳工藝為A1B1C3，即10%的乙醇10個柱體積以10-15 mL/min的流速洗脫，乙醇的用量對綠原酸的轉移率的影響最大，其次是乙醇濃度，影響最小的為乙醇的洗脫速度。乙醇用量越大，濃度越小，洗脫速度越小，綠原酸的轉移率越高。

運用Minitab軟件對最佳工藝A1B1C3的結果進行預測，預計綠原酸的轉移率為88.34%。

2.5 洗脫工藝驗證結果

結果三次試驗綠原酸的轉移率分別為 87.25%、88.94%、87.98%，與預測結果相符。

2.6 萃取工藝研究結果

結果表明，濃縮至藥材：藥液=2:1的濃度，用等量乙酸乙酯萃取8次，合并萃取液后濃縮干燥即可。驗證結果表明，最終提取物中綠原酸轉移率為77.21%，含量為91.24%。

表4 萃取工藝研究結果

3.討論

金銀花葉中綠原酸以游離態和結合態（鹽）共同存在，降低pH可使結合態的綠原酸轉化為游離態，因而上大孔樹脂柱前將提取液pH調節至2.5使其以游離態存在，以提高吸附量，從而提高得率。綠原酸具有酚羥基結構，有一定的親水性和極性，與弱極性和極性樹脂易于發生吸附作用，經試驗選擇了極性樹脂D101。

一般金銀花的入藥部位為花蕾或初開的花，隨著對其化學成分的研究發現其葉中亦有豐富的綠原酸，金銀花價格較貴，采用來源豐富的金銀花葉可以降低成本。采用本文最終的工藝所制得的提取物中綠原酸含量達90%以上，可將其作為中藥5類新藥開發，具有極高的開發價值。

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1672-5018（2016）11-015-02