功能性蛋白口服制劑的研究進展

摘 要：隨著功能性蛋白應用的愈發廣泛，口服給藥途徑以其方便、安全、高順應性等優點成為當下提高生物利用率的研究熱點。本文結合文獻，對常用的口服給藥系統，包括化學修飾、功能改善及運送載體等進行簡要綜述。

關鍵詞：口服給藥；功能性蛋白

中圖分類號：S816.79 文獻標識碼：C 文章編號：1001-0769（2016）04-0085-03

伴隨著生物技術日新月異的發展，越來越多的具有生理活性的多肽或蛋白分子被發現，使得功能性蛋白在現代疾病預防和治療中逐漸占據重要位置。同時利用轉基因動、植物實現了活性蛋白的批量生產，使得針對功能性蛋白給藥系統的研究愈發深入。功能性蛋白具有體內作用明確、藥理作用強、免疫源性低、毒副作用小等優點，但與傳統合成藥物相比，蛋白多肽類藥物，穩定性差、易變，在體內半衰期短，分子量大，對pH及體內酶變化敏感，難以穿透機體對其形成的天然屏障，化學和構象不穩定等問題極大地限制其應用范圍。如何提高功能性蛋白的生物利用率，提高穩定性，改變其給藥途徑成為這類藥物制劑研究的關鍵問題。

在眾多給藥途徑中，口服給藥系統以其較高的生物利用率、用藥順應性及安全型備受研究開發者的青睞，成為當前生物技術藥物最熱門的研究方向之一。目前已有少量生物技術類藥物上市應用，如：口服干擾素、胸腺肽、胰島素等。現常用功能性蛋白口服制劑的制備方式主要有以下三種：（1）化學修飾；（2）功能改善；（3）運送載體。本文結合相關文獻，主要對常用的口服給藥系統的制備工藝及優缺點進行簡單總結。

1 化學修飾

蛋白質的化學修飾包括主鏈結構和側鏈基團修飾兩種，目前針對改變側鏈基團的研究較多。通過化學修飾，可有效降低或消除免疫原性，減少藥物分子的毒副作用，提高功能性蛋白的穩定性，同時增加跨膜滲透性，提高生物利用率、延長循環半衰期等。

常用的化學修飾方法有：氨基酸替換、環化、乙酰化、PEG化等。在右旋糖苷、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、PEG等眾多修飾劑中，以PEG類修飾劑最為常用[1]。PEG類修飾劑相較于其他修飾劑，它毒性小、無抗原性、具備良好的兩親性，且該聚合物具有得到FAD認證的生物相容性。1990年，PEG修飾的腺苷脫氨基酶成為通過FDA認證的第一種修飾蛋白。PEG化后的藥物分子量增大，從而避免了腎小球過濾；親水性增加，減少蛋白水解酶對其降解，提高穩定性；與藥物間形成化學鍵合，水解過程達到緩釋效果。

雖然目前已有多種PEG化功能性蛋白進入市場，但傳統的化學修飾方式存在修飾劑聚合度不一、選擇性不夠高，修飾后的藥物分子量分布寬，改性或降低其生物活性、穩定性低于理想值等突出問題。化學修飾仍需依靠綜合性修飾劑的制備、修飾條件的探索來提高其可行性。

2 功能改善

2.1 吸收促進劑

吸收促進劑是指具有可逆、特異或非特異性的，增強胃腸道對功能性蛋白吸收作用的一種小分子化合物，通過促進劑的使用，可提高血液中藥物的濃度和生物利用率。

吸收促進劑主要利用以下幾種作用機理：① 擾亂細胞膜上的磷脂層，達到增強細胞膜的流動性、降低黏膜層粘度效果，形成細胞膜孔，提高細胞膜的通透性。② 抑制蛋白水解，提高藥物穩定性；③ 增加靶部位單位時間的血流量，提高細胞膜內外藥物濃度梯度；④ 促進劑的陽離子與膜表面的陰離子結合，增加黏附能力，促進吸收，提高生物利用率等。

不同理化性質的天然或合成的輔料都具有促進藥物吸收的作用，常用的吸收促進劑有：生物粘附性高分子聚合物、脂肪酸及其衍生物、表面活性劑等。近年來的研究熱點集中于殼聚糖及其衍生物。殼聚糖、卡波姆等本身就是無毒性藥用輔料[2]，在功能性蛋白研究中主要應用其生物黏附性及促吸收作用，研究證明殼聚糖及其衍生物的促吸收作用優于卡波姆，效果較明顯。吸收促進劑的選擇應遵循理化性質合理、可逆；少毒或無毒無副作用；可循環再生；作用部位明確；價廉易得等原則。但研究發現，使用過程中促吸收機理亦是毒性反應的機理，在促進胃腸道吸收功能性蛋白的同時，也有可能促進腸道內對毒素和病原體的吸收。促吸收劑用法用量的偏差都會造成機體局部或全身性的毒性反應。如鈣離子螯合劑可導致細胞中鈣離子枯竭，破壞細胞的肌動蛋白絲，降低細胞間的粘附力[3]。

雖然對口服制劑中吸收促進劑已有一定程度的研究，但臨床應用還處于初級階段，無論促進劑的促進機理如何復雜，“安全、高效”將作為吸收促進劑選用的唯一準則。

2.2 酶抑制劑

胃腸道酶的降解作用是功能性蛋白口服生物利用率低下的主要原因，功能性蛋白與其代謝酶抑制劑一起使用，能顯著降低或者抑制代謝酶的活性，有利于促進功能性蛋白生物利用率的提高。常用的代謝酶抑制劑有：抑肽酶、Bowman-Birk抑制劑[4]、大豆胰抑制酶、桿菌肽及肝膽酸鈉和卡默斯塔甲磺酸鹽等。

不同于吸收促進劑，酶抑制劑的特異性要求功能性蛋白和酶抑制劑必須同時到達代謝部位，往往需要將酶與功能性蛋白共同包裹制成微囊、微球、納米粒等聚合物，Lee 等[5]選用腸溶材料EudraigitL 100制成了胰島素微球，并分別加入胰蛋白酶抑制劑、凝乳蛋白酶酶抑制劑、Bowman-Birk酶抑制劑，與胰島素包裹于上述微球體系中。大鼠給予上述微球后，抑酶譜范圍更廣的抑肽酶Bowman-Birk酶抑制劑，比對照組（未添加酶抑制劑的胰島素微球）降糖作用增加50 %以上，差異明顯；而胰蛋白酶抑制劑、凝乳蛋白酶抑制劑實驗組與對照組相比，無明顯差異。實驗說明酶抑制劑有利于功能性蛋白生物利用率的提高，但抑酶作用強弱，促吸收作用顯著與否取決于酶抑制譜的范圍。

酶抑制劑和功能性蛋白共同服用，能顯著提高功能性蛋白生物利用率，但動物體內研究結果也證明了，酶抑制劑的使用也存在許多不良反應[6，7]。酶抑制劑影響了胃腸道對正常營養性蛋白的消化吸收，同時反饋調節也刺激了酶的分泌，長期使用易導致脾臟肥大增生，過量使用會造成機體多系統產生毒性反應。因此，在新藥物控釋系統及劑型的研發中，如何限定抑制劑不被釋放從而降低其毒副作用，是亟需解決的問題。

3 運送載體

運送載體亦可稱為微粒載體。微粒載體可同時滿足保護功能性蛋白在消化道劇烈環境中免受酶系統的降解，提高藥物在黏膜上皮的透過效率。目前被廣泛應用的有：脂質體、微球及納米粒等，功能性蛋白制成粒徑合適的納米粒、微球、脂質體，不僅能減少和避免藥物口服時的酶解作用，提高生物利用率，還可以起到緩釋的作用。

3.1 脂質體

脂質體是將藥物包裹在類脂質雙分子層的超微型球狀載體制劑，根據結構的不同，直徑分布幾十納米至數微米不等。脂質體具有：①生物相容性好；②同時兼容包裹親水性和疏水性藥物；③無毒副作用，生物利用率高，免疫原性低；④避免體液對所載藥物的稀釋、體內酶的分解破壞等優點[8]。常用的制備方法[9]有薄膜分散法、超聲波分散法、離子梯度法、逆向蒸發法、溶劑注入法、冷凍干燥法、聯合制備法等，針對不同的性質包封藥物選擇相應的制備方式。顧一珠等[10]利用薄膜分散-超聲法制備葛根素脂質體，并進行小鼠灌服測試其相對生物利用率，葛根素脂質體對葛根素的相對生物利用率為168.2 %，改善了葛根素的口服吸收。

盡管有多種制備方法，但脂質體制備目前還存在各種各樣的問題，尤其以包封率和穩定性低為突出問題，同時其靶向作用主要集中在肝、腎、脾等器官，對其他組織的靶向性不明顯，限制其應用。高壓均質機等新型制藥設備的出現，在提高脂質體均勻性和穩定性方面起到一定的推動作用，但依然無法完全滿足脂質體工業化的需求。

3.2 微球

微球是以清蛋白、聚乳酸等可降解材料制成的，粒徑在1 μm～500 μm左右的球形載體給藥系統，其中粒徑小于500 nm，通常又稱為納米粒。近年來，常應用微球給藥系統制備水溶性差、胃腸道滲透率低、口服生物利用率低的藥物的口服藥[11]。利用可降解材料制備的蛋白控釋微球具有高生物利用率、低藥物毒副作用、血藥濃度恒定、控釋及靶向等優點。

常用的微球制備方法有：溶劑提取法、溶劑揮發法、相分離法、噴霧干燥法、超臨界流體技術等，應用中多采用溶劑提取法、溶劑揮發法與相分離法，前兩者適用于非水溶性藥物的包載，而相分離法更適用于包載水溶性藥物。黃慧等[12]利用殼聚糖為載體，制成胰島素微球，灌服小鼠進行降糖測試，血糖最大降幅為50.2 %，而諾和靈中效胰島素皮下注射降糖血糖最大降幅58.7 %，結果證明殼聚糖胰島素微球口服制劑對大鼠有降糖效果，且與諾和靈中效胰島素皮下注射降糖效果無統計學差異。

微球系統的粒徑大小是影響其在小腸吸收和體內生物分布的重要因素[13]，粒徑越大，包封率和裝載量越高；而粒徑較小的微球具有更大的比表面積，可有效提高功能性蛋白口服的生物利用率。根據不同疾病類型和病變位點，選擇相應載體，制備不同粒徑大小的各型微球，可以使微球能迅速達到相應的靶向器官，并在靶部位持續維持有效濃度。

3.3 納米粒

納米粒載體屬于納米級微觀范疇的藥物載體運輸系統，通常是指粒徑在10 μm～1 000 nm之間，是一類以天然或人工合成的高分子材料為載體的膠體微粒。納米粒利用空間位阻對包裹的藥物進行保護，具有跨越黏膜屏障、改變藥物在體內分布的優點；較強的靶向性可以減少某些藥物的不良反應；長效的藥物濃度維持可達到更佳的治療效果，同時納米粒制備材料及方法靈活多樣，為功能性蛋白口服給藥系統研究提供更多參數條件。

理想的納米粒應具備[14]：①有較高的載藥量，如﹥30 %；②具有較高的包封率，如﹥80 %；③有適宜的制備及提純方法；④載體材料具有生物降解性，毒性較低或無毒；⑤具有適宜的粒徑和粒形；⑥具有較長的體內循環時間。韓麗娜等[15]采用二次乳化法制備胰島素/維生素B12修飾透明質酸鈉米粒（INS/VB12-HA NP），以糖尿病模型大鼠降血糖實驗評價口服給藥體系藥效，VB12-1-HA、VB12-2-HA、VB12-3-HA三組在8 h后血糖量分別為初始血糖的（50.47±11.82） %、（62.22±13.25） %、（56.22±8.40） %，而口服胰島素溶液組的降糖作用為（91.84±2.10） %，證明與口服胰島素溶液相比，納米粒組均有顯著的降血糖作用。

常規納米粒口服給藥后，大部分納米粒因不能黏附小腸黏液層而導致停留時間過短，包載藥物未能達到完全釋放。同時小腸上皮層連接致密、蛋白多肽較高的親水性，使得胃腸道難以吸收釋放藥物，從而降低了納米粒口服制劑的生物利用率。通過提高納微球的黏膜粘附性和靶向性，可以很好地解決這一難題，主要依靠：改變納微球的粒徑；表面電荷；表面修飾、連接靶分子等方式來提高納微球的黏膜粘附性、小腸黏膜的通透性和靶向性[16]。Reineke等[17]分別制備了500 nm和1 μm、2 μm、5 μm的聚苯乙烯納米粒，研究其在腸道的吸收、轉運和分布情況，結果顯示小腸對不同粒徑的納米粒均有吸收，且粒徑越小，其在小腸的吸收越多；帶正電荷的納米粒更易粘附于帶負電荷的小腸黏液層，利用納米粒和小腸黏液層的相互作用來延長藥物在小腸的停留時間；親水性納米粒更易通過小腸黏液層，且在黏液和血液中穩定，而疏水性納米粒更容易被細胞攝取，Yuan等[18]用 PEG 對納米粒進行表面修飾，結果顯示，10 % PEG修飾后，納米粒通過黏液層量增加，上皮細胞攝取量無明顯變化，生物利用率較未修飾納米粒提高99 %，而20 % PEG修飾納米粒后，上皮細胞攝取量明顯降低，因此納米粒表面達到合適的親水-疏水平衡更有利于提高生物利用率。

4 結語

綜上所訴，相較于化學修飾、吸收促進劑等功能性制劑添加以及脂質體、微球，納米粒具有無可比擬的優點，是目前研究較為深入廣泛的口服給藥載體。但不可否認的是，納米粒體系復雜，作為口服給藥載體的影響因素過多，最佳因素參數組合仍有待確認；且當前蛋白口服給藥系統研究僅局限在提高蛋白多肽的口服利用度上，如何達到蛋白進入機體后的控制釋放、定點靶位研究相對較少；制作成本高昂等諸多障礙，使得功能性蛋白口服制劑真正完全進入臨床應用還需更多數據支持。但隨著新材料的發現、制備工藝方法的提高及加工設備的完善化，蛋白口服制劑的發展潛力是無窮的，依然有光明的發展前景。

參考文獻：（18篇，略）