UPLC—MS/MS法測定動物源食品中金剛烷胺殘留

摘 要：建立動物源性食品中金剛烷胺的高效液相色譜-串聯四級桿質譜（UPLC-MS/MS）殘留分析方法。樣品用 1 %乙酸乙腈提取，加入正己烷除雜；吹干濃縮后用0.1 %甲酸水溶液+甲醇（V∶V=1∶1）溶解，以0.1 %甲酸水溶液-甲醇為流動相，經C18柱分離，采用多反應監測（MRM）正離子模式進行檢測。實驗結果表明，金剛烷胺提取效果好，檢出限為0.05 μg/kg，在1.0 μg/kg～10.0 μg/kg添加水平的平均回收率在89.4 %～110.2 %之間，相對標準偏差為2.02 %～4.31 %。本方法適用于動物源性食品中金剛烷胺殘留檢測。

關鍵詞：金剛烷胺；高效液相色譜-串聯質譜；抗病毒

中圖分類號：S859.79+6 文獻標識碼：A 文章編號：1001-0769（2016）07-0064-04

金剛烷胺（別名：三環癸胺）是最早用于抑制流感病毒的抗病毒藥，廣泛用于人類流感治療.但是，將人用抗病毒藥物用于畜禽，不僅容易導致動物源性食品中藥物殘留、動物中毒、動物機體產生免疫抑制和耐藥性等問題，還可導致病毒發生變異，影響動物疫病控制及人用抗病毒藥物的有效性。我國農業部2005年第560號公告明確規定金剛烷胺等抗病毒藥物在獸醫上禁止使用[1]，美國FDA于2006年也禁止將金剛烷胺等人類抗病毒藥物用于畜禽類。

目前，文獻資料中關于金剛烷胺在動物源性組織內殘留的檢測方法較少，國家和行業標準也是空白，對此類藥物的監管帶來了不便。而雞肉中殘留的金剛烷胺含量低，基質干擾大，急需有效的前處理方法和高靈敏度的檢測技術。目前，金剛烷胺的檢測方法有液相色譜法、毛細管電泳法[5] 、液相色譜-質譜法[2-4]等，其中液相色譜串聯質譜法以其高靈敏度和可靠的確證性能，正得到越來越廣泛的應用。本文采用超高效液相色譜質譜法（UPLC-MS/MS）測定雞肉中金剛烷胺的殘留量，并對樣品前處理方法和儀器分析條件進行系統優化，為禽類養殖環節金剛烷胺藥物的監控提供了技術支持

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

AcQuity UPLC/XeVo TQMS液相色譜串聯質譜聯用儀（美國Waters公司），電子天平（Mettler Toledo公司型號：PL2002），高速冷凍離心機（SIGMA公司，型號3K15），純水機（德國Millipore公司），渦旋混勻器（vortex Genie2型）。

金剛烷胺（Chroma DEX公司，0.1 g/支），金剛烷胺-D15（加拿大TRC公司，1 mg/支），甲醇、乙腈（色譜純，Merck公司）；甲酸（色譜純，Aladdin公司）無水硫酸鈉、冰乙酸。

標準溶液：精確稱取10 mg金剛烷胺標準品用甲醇定溶于10 mL棕色容量瓶中，配制成1.0 mg/mL金剛烷胺標準儲備液，精確稱取1 mg金剛烷胺-D15標準品用甲醇定溶于10 mL棕色容量瓶中，配制成0.10 mg/mL金剛烷胺-D15標準儲備液，-18 ℃以下避光保存。

1 %乙酸乙腈溶液：取冰乙酸10 mL，用乙腈稀釋至1 000 mL。

0.1 %甲酸水溶液：取1 mL甲酸，用水稀釋至1 000 mL。

1.2 樣品前處理

取雞肉充分絞碎，勻質，-18 ℃以下避光保存。

稱取2.00 g（精確到0.01 g），樣品于50 mL離心管中，加入濃度為1 μg/mL 的金剛烷胺-D15內標工作液0.04 mL，然后加入1 %乙酸乙腈溶液10 mL，漩渦2 min，3 000 r/min離心5 min，上清液轉入另一50 mL離心管中，重復提取一次，合并兩次上清液，備用。備用液中加入無水硫酸鈉3 g，正己烷10 mL，渦旋1 min，3 000 r/min離心5 min，棄去正己烷層，剩余溶液轉移至另一50 mL離心管中，40 ℃水浴中氮氣吹干，加入1 mL甲醇： 0.1 %甲酸水溶液（體積比為1﹕1），渦旋30 s，10 000 r/min離心5 min，取上清液供上機測定，過0.22 μm濾膜，進樣，UPLC-MS/MS測定。

1.3 色譜質譜條件

ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，3.0 mm×100 mm），柱溫：40 ℃；流動相及洗脫條件如下A為甲醇，B為0.1 %甲酸水溶液，流速為0.6 mL/mim，梯度洗脫：起始時間至0.5mni 30 %A+70 %B，0.5 min至 3 min 90 %A+10 %B，3 min至5 mni 10 %A + 90 %B，采用多反應監測（MRM）模式，分別對金剛烷胺和金剛烷胺-D15標準液進行一級離子掃描，確定化合物的電離方式和分子離子，在獲得分子離子峰（母離子）質荷比后，再進行二級質譜（子離子）掃描，優化碰撞能量，確定兩個豐度比較高的子離子作為定性和定量離子。在ESI（+）檢測模式下，化合物質譜采集參數見表1

1.4 方法靈敏度確定

將適量金剛烷胺加入到空白雞肉中，制成 0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、2.0 μg/kg三個濃度添加樣品，經上述方法進行前處理后，用超高效液相色譜質譜法檢測，觀察藥物特征離子質量色譜峰信噪比（S/N）和對應藥物濃度，S/N>3 者定其為方法的檢測限；S/N>10 者定其為方法的定量限。

1.5 準確度和精密度的測定

采用標準添加法，在空白雞肉中各添加 1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、10 .0 μg/kg三個不同濃度藥物進行回收率試驗，各濃度進行6個樣品平行試驗，求RSD。

2 結果與討論

2.1 標準曲線與定量限

配制金剛烷胺的質量濃度為0.10 μg/L～ 10.0 μg/L的基質匹配的標準工作液，內標濃度均為4.0 μg/L，以目標物峰面積與內標峰面積的比值Y為縱坐標，以標準工作液的濃度X（μg/L）為橫坐標，進行線性回歸分析，繪制標準曲線如圖1。

以加標樣品中待測化合物色譜峰的信噪比等于3對應的濃度為方法檢出限，確定雞肉中的金剛烷胺的檢出限為0.05 μg/kg。其中空白基質及添加藥物樣品色譜圖譜見圖2和圖3。

2.2 方法回收率實驗

分別取雞肉空白樣品，進行加標回收試驗，加標濃度分別為1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、10.0 μg/kg。將加標樣品和空白樣品按前述方法進行處理，上機測試，結果見表2，表3和表4。

2.3討論：樣品前處理方法的選擇

從雞肉樣品中提取利巴韋林和金剛烷胺通常使用酸化或堿化的甲醇、乙腈等[2-4]。樣品提取液中常含有大量的蛋白質，1 %的乙酸溶液能夠使蛋白質沉淀并抑制蛋白與這些分析物結合。選擇該溶液與甲醇、乙腈組成適宜濃度的混合溶液作為提取液，比較了不同配比提取液的提取效率，發現含有金剛烷胺的樣品用1 %乙酸乙腈混合溶液有較高的回收率。

文獻報道金剛烷胺的除雜凈化都是用不同類型的SPE小柱來實現的，包括活化-上樣-淋洗-洗脫等步驟繁瑣，耗時長[2-4]。我們通過實驗比對，發現不使用SPE柱，直接加入10 mL的正己烷除脂除雜后，氮吹后，用甲醇﹕0.1 %甲酸水溶液（體積比為1﹕1）溶解殘渣，渦旋30 s，10 000 r/min離心5 min，取上清液過膜上機檢測，目標物分離效果好，基質干擾很少，空白基質圖譜（圖1）及2.0 μg/kg陽性加標色譜圖（圖2），完全能達到檢測要求。因此我們采用加正己烷除脂吹干后，直接溶解殘渣，離心過膜的方法，大大節省了人力，物力。

3 結論

本方法建立了雞肉中金剛烷胺的超高壓液相色譜-串聯質譜的測定方法。樣品經過酶解、提取、凈化，有效地消除了基質干擾，方法具有較高的靈敏度，以金剛烷胺- D15為內標，提高了定量準確性。經過優化試驗驗證，一系列濃度的標準樣品溶液（0.1 μg/L、0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、 4.0 μg/L、10.0 μg/L）的標準曲線相關系數R2=0.999 9；方法檢出限確定為0.05 μg/kg，滿足日常檢測需要；在1.0 μg/kg～10.0 μg/kg添加水平的平均回收率在89.4 %～110.2 %之間，相對標準偏差為2.02 %～4.31 %；通過回收率和多種食品樣品的實測實驗證明：上述方法樣品前處理方法簡便、快捷、易操作，液相色譜串聯質譜的條件設置合理，相關參數優化較佳，靈敏度較高，可準確進行定性、定量檢測，適用于可食動物肌肉、肝臟、雞蛋中金剛烷胺殘留的檢測。

參考文獻：

[1] 中華人民共和國農業部.農業部560號公告獸藥地方標準廢止目錄.

[2] 白亞敏，楊小珊，毛 慶，等.超高效液相色譜質譜法測定雞肉中抗病毒類藥物殘留[J].食品工業科技，2014，24（7）：76-78

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