利用Gn1a基因進行粳稻穗粒數改良的研究

摘要：增加穗粒數是提高水稻產量的有效途徑，為了培育高產中熟粳稻新品系，采用回交育種并結合分子標記輔助選擇技術，將感溫型大穗品系HK05418的大穗基因Gn1a導入到感光型優質晚粳品種秀水134中。在BC2F4代得到農藝性狀穩定、等位基因純合、早熟且每穗粒數、單株產量顯著優于秀水134的穩定株系C3068。

關鍵詞：粳稻；Gn1a基因；分子標記輔助選擇；穗粒數

中圖分類號：S330 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）21-5455-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.005

Study on Improving Grain Number of Japonica Rice by Using Gn1a Gene

YIN De-suo，LI Jin-bo，WAN Bin-liang，FANG Guo-cheng，QI Hua-xiong

（Food Crop Research Institute，Hubei Academy of Agricultural Science/Hubei Key Laboratory of Food Crop Germplasm and Genetic Improvement，Wuhan 430064，China）

Abstract： Increasing grain number is a reliable way to abstain high yield of rice. In order to develop new japonic lines possessing high yield potential，the Gn1a MAS（molecular assistant selection） assay was carried out，the 1 allele of Gn1a in HK05418 was transferred to the target variety，Xiushui 134. By backcrossing，inbreeding，screening and selecting，a new line C3068 from BC2F4 was identified as more early maturing and high yield than the control variety Xiushui 134.

Key words： japonica rice； Gn1a gene； molecular assistant selection； grain number

水稻（Oryza sativa L.）高產一直是育種者追求的目標。水稻的單位面積產量由單位面積內的有效穗（分蘗數）、穗粒數、結實率及粒重（粒型）共同組成。與水稻分蘗能力和粒重、粒型相關的主效基因近年不斷被報道，例如控制粒型和粒重的GS3[1]、GW2[2]、GW5[3]、GW8[4]、GW7[5]等，控制分蘗數的MOC1[6]，控制穗粒數的Ghd7[7]和Gn1a[8]等。這些主效基因的鑒定和克隆，使得利用分子標記輔助選擇來進行水稻產量性狀的改良成為了可能。

近年來，隨著人們生活水平的提高，由于品質和口感較好，粳稻發展較快，種植區域已經從東北向華東、華中、華南地區延伸[9]。湖北省在繼江蘇、安徽等省進行“秈改粳”后，也開始了水稻的產業結構調整。20世紀70年代，湖北粳稻由于產量潛力較低而逐漸被雜交秈稻取代，鑒于此，要擴大湖北省粳稻種植面積，需要培育適應湖北省稻區光溫條件、產量潛力更高的新品種。

Gn1a基因編碼細胞分裂素氧化酶，可以降低幼穗原基中分裂素的表達水平，從而減少穗部穎花數量，而Gn1a基因功能缺失的單倍型會導致穗粒數增多[8]。本研究針對粳稻的產量性狀，利用設計的Gn1a基因分子標記，篩選Gn1a基因功能缺失的粳稻種質資源，采用雜交育種并結合分子標記選擇的方法，將目的基因導入受體品種，對優良品種進行穗粒數改良，旨在提高產量潛力，培育粳型中稻新品系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

HK05418為湖北省農業科學院育成的感溫型大穗粳稻品系，作為大穗型Gn1a基因供體親本；秀水113、秀水134為浙江省嘉興市農業科學院育成的優質感光型晚粳品種，對稻瘟病抗性較好，分蘗較多，中小型穗型；秀水519為嘉興市農業科學院育成的早熟優質粳稻品種，作為生產對照材料；上海粳1號和上海粳2號為上海市農業科學院育成的優質晚粳品系，用作引物篩選。

1.2 引物設計

根據Ashikari等[8]報道的Gn1a基因編碼區的突變位點，在缺失突變區的兩端設計PCR擴增引物，經過引物篩選，選擇分辨率較高的擴增引物作為該性狀的候選分子標記。

1.3 基因檢測方法

采用改良的CTAB法[10]提取水稻葉片總DNA。引物序列由上海生工生物工程技術有限公司合成。PCR反應在PE公司9700型熱循環儀上進行，擴增反應物的總體積為15 μL，其中包括1×PCR緩沖液，Mg2+ 1.5 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，上下游引物各為50 pmol，水稻基因組DNA 1.5 ng/μL，Taq酶1 U（TaKaRa公司產品）。反應程序為：95 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 5 min。PCR產物于6%非變性的聚丙烯酰胺凝膠上分離，銀染操作參照李進波等[11]的改良方法。

1.4 產量性狀調查

考察單株穗數、每穗粒數和實粒數，并統計結實率。統計小區的播始歷期和單株的實收產量。

1.5 米質分析

主要統計糙米的堊白粒率和堊白度，觀察比較米粒的透明度和油分、光澤等品質性狀。

2 結果與分析

2.1 Gn1a基因分子標記在親本材料中的多態性

用primer 3.0的在線引物設計程序，根據目標基因編碼區內的缺失突變位點，設計了PCR擴增引物（Gn1aF：5′gctatctatcagctgccttc3′，Gn1aR：5′cctgctctt gcttcattatc3′）。用所設計的引物在大穗品系HK05418和小穗型品種秀水113、秀水134、上海粳1號、上海粳2號等品種間進行多態性驗證，PCR產物經聚丙烯酰胺凝膠5 V/cm電壓分離，不含Gn1a基因的小穗型品種擴增出了較大的產物條帶（日本晴參考序列為167 bp，圖1），而大穗品系HK05418擴增出較小的PCR產物條帶（圖2）。

2.2 分離群體的標記檢測

將秀水134/HK05418組合F2分離世代的單株表型和基因型進行對比驗證，結果表明，含大穗基因型（Gn1a）單株的平均穗粒數為187.8～205.6粒，明顯多于小穗基因型（gn1a）單株的129.2～162.8粒，即基因型與表型共分離，證明Gn1a基因確實是該分離群體中控制穗粒數的主效基因（圖3）。

2.3 大穗材料的培育

2009年夏季在武漢配制秀水134/HK05418的F1組合，2010年春在海南、2010年夏在武漢連續用秀水134作為母本進行回交，得到BC2F1，然后連續自交。在上述回交和自交世代采用標記輔助選擇，選擇含大穗Gn1a基因型的單株進行回交和自交，于2012年夏得到目標基因純合、農藝性狀穩定的BC2F4家系。

在自交世代，除了進行大穗性狀選擇，同時進行生育期的選擇。由于秀水134是晚粳品種，發育特征表現為較強的感光性，而HK05418為感溫性品種，兩者雜交后代出現了感溫性和感光性的分離，攜帶發育感溫基因的單株在海南生育期較長，而在武漢則較短；攜帶感光發育基因的單株則相反。針對熟期進行單株選擇的策略是在海南選擇長熟期（感溫型）單株，在武漢選擇短熟期單株，以此方法淘汰掉含有發育感光基因型的單株。再經自交穩定后，育成適合湖北省稻區的大穗、早熟、矮稈的粳型中稻新品系C3068（圖4）。

2.4 綜合農藝性狀評價

與親本對照相比，育成的大穗新品系株高較低，熟期較早，穗粒數較多（圖5，表1），達到了品種改良的主要目的。新品系外觀品質明顯優于HK05418，接近秀水134（圖6）。

經過2013-2014年武漢和仙桃兩地品種比較試驗表明，新品系豐產性較好，結實率與對照品種相比略低，但每穗實粒數和單株實粒數明顯高于對照（表1）。

2.5 稻瘟病抗性鑒定

2013年將大穗粳稻新品系在宜昌和恩施病區進行稻瘟病抗性鑒定，結果表明，新品系的葉瘟和穗瘟抗性達到抗和中抗水平，與對照水平相當（表2）。

3 討論

本研究采用自行設計的Gn1a基因的分子標記，對優質晚粳品種秀水134進行穗粒數改良，同時對熟期和抗性進行了篩選，得到了大穗、早熟、矮稈、抗稻瘟病的優質粳型中稻新品系。研究結果表明，通過Gn1a基因的分子標記輔助選擇進行穗粒數改良是有效的。

水稻產量一般由單位面積內穗數、平均穗粒數、結實率和千粒重等因子決定，而這些產量決定因子都是由數量性狀基因控制的，傳統的育種方法很難進行有效的后代選擇，必須借助于可靠的標記選擇。同時，各個因子間也會存在復雜的互作和協同變化現象，例如，穗粒數增加可能會導致結實率下降；生育期縮短會導致分蘗數和穗粒數的下降。因此，在利用分子標記進行目標性狀的選擇時，兼顧其他相關性狀的變化及選擇仍然非常重要。同時保證一定規模的選擇群體也是必要的，這樣為打破不利連鎖提供了可能。

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