正交試驗優(yōu)化仙桃草總黃酮提取工藝

摘要：通過單因素試驗和正交試驗對仙桃草（Veronica anagallis-aquatica L.）中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，仙桃草中總黃酮提取的最佳工藝條件為提取溶劑55%的乙醇、提取溫度65 ℃、提取時間90 min。在最佳工藝條件下仙桃草總黃酮提取率達(dá)0.270 1%。

關(guān)鍵詞：仙桃草（Veronica anagallis-aquatica L.）；總黃酮；正交試驗

中圖分類號：R282.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）21-5588-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.038

Optimize the Extraction Technology of Total Favonlids in Veronica anagallis-aquatica L. by Orthogonal Experiment Method

XIAO Qiu-xianga， PENG Xiang-junb， LI Yin-baob

（a.College of Basic Medical；b.College of Pharmacy，Ganan Medical University，Ganzhou 341000，Jiangxi，China）

Abstract：The extraction technology of total flavonoids in Veronica anagallis-aquatica L. were optimized by single factor test and orthogonal test. The results showed that the best extraction process conditions in Veronica anagallis-aquatica L. for total flavonoid were 55% of ethanol，65 ℃ and 90 minutes of extraction time. Under the optimum process of conditions，total flavonoid yield can reach to 0.270 1%.

Key words： Veronica anagallis-aquatica L.；flavonoids；orthogonal test

仙桃草（Veronica anagallis-aquatica L.）是玄參科植物，也稱為蚊母草、接骨草。在中國東北、華東、華中、西南各省均有分布。仙桃草中含有原兒茶酸、木犀草素、香草酸、金圣草素、甘露醇等多種有效成分。帶蟲癭的仙桃草全草入藥，具有活血止血，消腫止痛等功能，適用于跌打損傷、瘀血腫痛、骨折挫傷、各種出血等病癥[1，2]。仙桃草中的木犀草素具有抗腫瘤[3]、抗菌[4]、抗炎[5]、增強(qiáng)免疫、解痙、祛痰、保護(hù)心血管系統(tǒng)[6]等作用；金圣草素還具有抗過敏、抗炎等作用，這兩種化合物均具有黃酮母核。

總黃酮提取方法較多[7，8]。本試驗通過考察提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間對仙桃草總黃酮提取率的影響，采用正交試驗法獲得仙桃草中總黃酮的最優(yōu)提取工藝，以期為仙桃草資源的經(jīng)濟(jì)、合理利用提供有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：仙桃草，產(chǎn)地為安徽。

試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，天津一方科技有限公司；無水乙醇（AR，99.7%），天津市福晨化學(xué)試劑廠；石油醚（AR），天津福晨化學(xué)試劑廠；正丁醇（AR），上海潤捷化學(xué)試劑有限公司。

儀器：JA5003型電子天平購于上海市安亭電子儀器廠；WF-4000型微波快速反應(yīng)系統(tǒng)購于上海屹堯分析儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器購于上海亞榮生化儀器廠；Lambda 35型UV/VIS分光光度計購于Perkin Elmer公司；DHG-9070A型電熱恒溫干燥箱購于邦西儀器科技（上海）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的制備 精確稱取0.006 0 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，加入少量正丁醇溶解，轉(zhuǎn)至250 mL容量瓶中加正丁醇定容搖勻，靜置2 min。分別取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL上述蘆丁溶液置于25 mL比色管中，用正丁醇定容后待測得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以正丁醇為參比溶液，用紫外可見分光光度計在200～700 nm掃描蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，得到最大吸收波長為208 nm，因此使用此波長為檢測波長。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以蘆丁系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液體積分?jǐn)?shù)X為橫坐標(biāo)，吸光度Y為縱坐標(biāo)，建立相應(yīng)的直角坐標(biāo)系。用最小二乘法求得線性回歸方程，Y=0.198 4X-0.010 8，R=0.993 9，如圖1所示。

1.2.3 仙桃草總黃酮提取 稱取一定量干燥的仙桃草細(xì)粉，加入乙醇用微波提取，提取液用四層紗布過濾，殘渣同法再操作一次，合并濾液。抽濾，取濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至小于50 mL，加乙醇定容至100 mL備用。

取上述備用溶液，加入5倍體積的無水乙醇， 4 ℃靜置過夜，抽濾除去沉淀。取濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至50 mL左右，加入2倍體積蒸餾水，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用2倍體積的石油醚萃取3次，取下層溶液，再用2倍體積的正丁醇萃取3次，取上層溶液，將萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)小于50 mL，用正丁醇定容至100 mL待測。測量時準(zhǔn)確吸取1.000 mL待測液于50 mL容量瓶中，用正丁醇定容至刻度待用。

1.2.4 總黃酮含量測定 以正丁醇為參比溶液，將上述仙桃草總黃酮提取液用紫外可見分光光度計208 nm處測定其吸光度。再將吸光度代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程計算總黃酮提取率。

提取率=×100%

式中，m為仙桃草細(xì)粉質(zhì)量，c為待測液濃度。

1.2.5 單因素試驗 分別考察提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間對仙桃草總黃酮提取率的影響。 ①提取溫度對仙桃草總黃酮提取率的影響：65%的乙醇，提取30 min，設(shè)定提取溫度分別為45、55、65、75、85 ℃；②乙醇體積分?jǐn)?shù)對仙桃草總黃酮提取率的影響：65 ℃下提取30 min，提取2次，設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為45%、55%、65%、75%、85%；③提取時間對仙桃草總黃酮提取率的影響：65%的乙醇，65 ℃下提取2次，設(shè)定提取時間分別為15、30、60、90、120 min。

1.2.6 正交試驗方法 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間進(jìn)行3因素3水平正交試驗，試驗因素和水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 提取溫度對仙桃草總黃酮提取率的影響 由圖2可知，隨著提取溫度的升高，仙桃草中總黃酮提取率不斷增大，其中提取溫度在45～55 ℃，提取率變化最大。超過55 ℃時，提取率趨于平穩(wěn)。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對仙桃草總黃酮提取率的影響 由圖3可知，仙桃草中總黃酮提取率先升高后降低，可見乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響較大。在65%的乙醇提取時，提取率達(dá)到峰值。取55%、65%、75%這3水平進(jìn)行正交試驗。

2.1.3 提取時間對仙桃草總黃酮提取率的影響 由圖4可知，仙桃草總黃酮提取率隨提取時間的延長先升高，后緩慢降低。試驗采用的是微波提取，提取效率較高，而且提取了兩次。15～30 min，隨著提取時間的延長提取率明顯升高。提取時間延長，可溶性雜質(zhì)增加。植物蛋白質(zhì)、可溶性多糖析出增多，醇沉吸附總黃酮增多。30 min后，提取率變化不明顯。

2.2 正交試驗結(jié)果

由表2可知，3個因素對對仙桃草總黃酮提取率的影響從大到小為乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取溫度>提取時間，提取仙桃草總黃酮的最優(yōu)工藝組合為55%的乙醇，提取溫度65 ℃，提取時間90 min。

3 小結(jié)

采用微波提取法提取黃酮類化合物，與傳統(tǒng)工藝相比提取時間短、乙醇用量少、提取效率高較。本試驗將提取次數(shù)定為2次，料液比定為1∶10（m∶V）。

采用正丁醇溶解標(biāo)準(zhǔn)品并制作樣品，是考慮到正丁醇對總黃酮的提取比乙醇水溶液更有針對性，能最大限度避開仙桃草中可溶性雜質(zhì)的影響。對仙桃草總黃酮溶液的掃描也證實了這一觀點。樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收峰形狀相似，在208 nm處表現(xiàn)出強(qiáng)烈的紫外吸收。

通過正交試驗確定采用提取溫度65 ℃、提取時間90 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%進(jìn)行仙桃草總黃酮的提取，總黃酮提取率較高。其中，乙醇體積分?jǐn)?shù)是影響黃酮類化合物最重要的因素。與傳統(tǒng)浸提法相比，微波提取大大縮短了工作時間，提高了產(chǎn)量。

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