SRC—1對異位內膜雌激素調控的CXCL12表達的影響

[摘要] 目的 研究子宮內膜異位癥患者的異位內膜中類固醇激素受體輔活化子-1（SRC-1）和趨化因子配體12（CXCL12）的表達水平，從而了解SRC-1對異位子宮內膜雌激素（E2）調控的CXCL12表達的影響。方法 2014年9月—2016年9月，方便選擇在蘇州大學附屬第一醫院婦科因內異癥接受手術治療，術后標本證實為內異癥的15例患者的異位內膜及同期放置宮內節育器的無內異癥且月經周期正常的健康婦女10名的正常內膜，應用實時熒光定量RT-PCR方法比較正常子宮內膜和異位子宮內膜在月經的增生期和分泌期SRC-1和CXCL12mRNA表達水平。ELISA檢測沉默異位內膜SRC-1的表達對雌激素誘導異位內膜基質細胞表達CXCL12的影響。結果 正常子宮內膜基質細胞中SRC-1和CXCL12的表達呈現周期性變化，而異位內膜這兩種因子的表達并沒有周期性的改變。異位內膜SRC-1和CXCL12mRNA的表達與正常內膜相比明顯升高。沉默異位內膜SRC-1表達后，E2誘導的CXCL12表達下降50.04%（P<0.05）。 結論 類固醇激素受體輔活化子調控異位內膜表達CXCL12的作用中，SRC-1是雌激素的主要輔激活化子。

[關鍵詞] 甾體激素受體輔活化子-1；趨化因子配體12；子宮內膜異位癥

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2016）12（c）-0034-03

[Abstract] Objective To observe the expression of steroid coactivator-1（SRC-1） and steroid-induced CXCL12 in endometriosis （EMS） and to explore the roles of SRC-1in the steroid-induced CXCL12 expression in EMS. Methods Convenient selection from September 2014 to September 2016，15 endometriosis cases undergoing surgery in The First Affiliated Hospital of Soochow University were enrolled in this study.Their ectopic endometriosis were from ovarian endometriomata which were identified pathologically. The 10 normal endometrium were acquired from the healthy women with normal cycle. Quantitative real-time polymerase chain reaction was used to quantify the mRNA levels of SRC-1 and CXCL12 during the menstrual cycle. ELISA was adopted to analyze the steroids-induced CXCL12 expression before and after the SRC-1 was silenced by siRNA. Results The SRC-1 and CXCL12 showed marked cyclic differences in normal endometrium. There were no periodic variation in the expression of SRC-1and CXCL12 in ectopic endometrium throughout the menstrual cycle. The SRC-1 and CXCL12 of ectopic endometrium were significantly higher than that of normal endometrium. Silencing of SRC-1 significantly reduced the E2-induced CXCL12 expression to 50.04%（P<0.05）. Conclusion SRC-1 is the major coactivator of E2-induced CXCL12 expression in EMS.

[Key words] Steroid receptor coactivator -1； Chemokine ligand 12； Endometriosis of uterus

趨化因子配體12（CXCL12）是趨化因子家族成員之一，它通過和受體CXCR4結合，激活MAPK信號通路，可以促進胚胎發育，血管形成以及腫瘤的生長和遠處轉移[1]。CXCL12是雌激素調節基因，雌激素（E2）可以使子宮內膜基質細胞中CXCL12的表達升高[2]。Ruiz等[3]實驗研究表明內異癥患者CXCL12和CXCR4呈現高表達。類固醇激素受體輔活化子-1（SRC-1）是SRCs家族成員之一[4]，它可以增強許多核受體的轉錄活性，包括雌激素受體和孕激素受體。該實驗自2014年9月—2016年9月，方便選擇在蘇州大學附屬第一醫院婦科因內異癥接受手術治療，術后標本證實為內異癥的15例患者的異位內膜及同期放置宮內節育器的無內異癥且月經周期正常的健康婦女10名的正常內膜，采用RT-PCR方法，比較正常子宮內膜和異位子宮內膜中SRC-1和CXCL12的mRNA表達；通過siRNA沉默異位內膜SRC-1的表達，研究SRC-1對異位內膜雌激素調控的CXCL12表達的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 標本來源 異位子宮內膜取自于蘇大附一院婦產科15例EMS病人，均因卵巢子宮內膜異位囊腫行手術治療，標本經病理檢查證實為子宮內膜異位癥。正常子宮內膜取自無EMS病史行取環或上環的月經周期正常的健康婦女，病理檢查證實為正常的子宮內膜。其中增生（P）期內膜取自月經第5～14天，分泌（S）期內膜取自月經第15～28天。15例患者中增生期8例，分泌期7例。7例分泌期內膜標本全部用于分離異位內膜基質細胞，其中成功用于實驗者為5例。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒，逆轉錄試劑盒，17β-雌二醇（17β-E2，CXCL12ELISA試劑盒，二喹啉甲酸（BCA）試劑盒，抗SRC-1抗體，SRC-1的siRNA。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR技術檢測SRC-1和CXCL12的表達 SRC-1和CXCL12的引物根據GenBank中的mRNA序列采用Oligo 5.0軟件進行設計，上海生工生物技術有限公司合成。引物序列見表1。RNA提取及逆轉錄參照試劑盒說明書進行。定量PCR反應采用Power SYBR Green PCR試劑盒，7700型實時熒光定量PCR儀進行擴增和檢測。根據公式2-ΔΔCT計算目的基因與內參基因GAPDH的相對表達量。

1.2.2 細胞培養 原代細胞傳代到6孔板，傳代后的細胞達到80%匯片時，換用含有10～8 mol/L 17β-E2培養液繼續培養。分別于培養24、48、72、96 h后收集上清，采用ELISA法檢測上清中CXCL12的表達量。研究沉默SRC-1表達對雌激素誘導的CXCL12表達的影響，將異位內膜基質細胞以1×105/孔的密度傳至6孔板。Opti-MEM培養過夜，脂質體2 000介導SRC-1的siRNA（簡稱siSRC-1）轉染異位內膜基質細胞，終濃度為每孔100 nmol/L。轉染4 h后換用完全培養液培養，2 d后換用含有10-8 mol/L 17β-E2的培養液繼續培養3 d。

1.2.3 CXCL12酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測各組SDF-1α的表達水平：在E2作用后的24、48 h和72 h，分別收集上清用ELISA試劑盒檢測上清液中CXCL12的表達水平。

1.2.4 Western-Blot檢測轉染前后SRC-1蛋白表達水平 異位內膜基質細胞轉染siSRC-1后48 h抽提胞核蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋白，封閉液室溫孵育1 h，單克隆一抗4℃過夜，辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗室溫孵育1 h。采用ECL+PLUS試劑（Amersham Pharmacia Biotech）檢測特異蛋白條帶的顯色。實驗中的一抗分別為抗SRC-1抗體和內參蛋白PARP一抗抗體。

1.3 統計方法

數據采用SPSS 13.0統計軟件進行處理與分析，文中數據以均數±標準誤（x±s）表示，實驗至少重復3遍。組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 內異癥患者的異位子宮內膜和正常子宮內膜基質細胞中SRC-1和CXCL12的表達水平

實時定量PCR結果顯示，正常內膜中SRC-1和CXCL12的表達具有周期性變化。S期表達水平分別為（2.64±1.02）和（1.62±0.50），均顯著低于P期。而異位內膜中SRC-1和CXCL12的表達沒有這種周期性改變（P>0.05）。異位內膜S期SRC-1表達水平為（5.44±1.27），正常內膜S期SRC-1表達水平為（2.64±1.0），二者相比差異有統計學意義，見表2。

2.2 雌激素對于異位子宮內膜基質細胞SDF-1表達的影響

在表2中觀察到S期異位內膜SRC-1和CXCL12表達均高于正常內膜，因此在以后的實驗中選取了S期的異位內膜基質細胞來觀察類固醇激素對SDF-1表達的影響。結果如圖1所示，與對照組比較，10-8 mol/L E2顯著增加CXCL12的表達。

3 討論

子宮內膜異位癥是指子宮內膜組織（腺體和間質）出現在子宮體以外的部位。異位內膜可以侵犯全身任何部位，但絕大多數位于盆腔臟器和壁腹膜，以卵巢和宮骶韌帶最常見，其次為子宮及其他臟腹膜，陰道直腸膈等部位。由于內異癥是雌激素依賴性疾病[5]，在自然絕經和人工絕經后，異位內膜病灶可逐漸萎縮吸收，使用性激素抑制卵巢功能，可暫時阻止疾病發展[6]?？梢姶萍に卦趦犬惏Y的發生發展中起重要作用。

CXCL12通過和受體CXCR4結合，可以促進胚胎發育，血管形成以及腫瘤的生長和遠處轉移。Hall JM等[7]試驗研究表明，在卵巢組織中，尤其是內異癥組織中，CXCL12/CXCR4表達明顯增多，與該研究結果相一致。此外，CXCL12是雌激素調節基因，雌激素（E2）可以使子宮內膜基質細胞中CXCL12的表達升高，所以內異癥患者中高雌激素水平導致CXCL12呈現高表達。

類固醇激素受體輔激活子家族（SRCs）是一類相對分子質量約為160×103的輔激活因子，包括3個同系成員SRC-1，SRC-2，SRC-3。SRC蛋白家族主要對類固醇受體如雌激素受體、孕激素受體、甲狀腺素受體以及糖皮質激素受體等發揮轉錄調節作用， 對機體的生長、發育以及生殖產生重要的影響[8]。

研究結果顯示，雌激素誘導的CXCL12表達水平為（2313±357）ng/L，顯著高于雌激素培養前的（614±130）ng/L，說明雌激素可使異位內膜基質細胞中CXCL12表達增加，這與Tsutsumi等[2]對正常子宮內膜的研究結果一致。沉默異位內膜基質細胞中SRC-1表達后，雌激素誘導異位內膜基質細胞表達CXCL12的水平為（1155±244）ng/L，較SRC-1沉默前的表達水平下降50.04%（P<0.05）。說明沉默異位內膜基質細胞中SRC-1可明顯減少E2誘導的SDF-1表達。因此，該研究推論SRC-1是雌激素的主要輔激活子。

[參考文獻]

[1] Wojcechowskyj JA， Lee JY， Seeholzer SH，et al.Quantitativephosphoproteomics of CXCL12 （SDF-1） signaling[J].PloS ONE，2011（5）：124-129.

[2] Tsutsumi A， Okada H， Nakamoto T， et al. Estrogen induces stromal cell-derived factor 1 （sdf-1/cxcl12） production in human endometrial stromal cells： A possible role of endometrial epithelial cell growth[J].Fertil Steril，2011，95：444-447.

[3] Ruiz A， Salvo VA， Ruiz LA， et al. Basal and steroid hormone-regulated expression of cxcr4 in human endometrium and endometriosis[J].Reprod Sci，2010，17：894-903.

[4] Onate SA， Tsai SY， Tsai MJ， et al. Sequence and characterization of a coactivator for the steroid hormone receptor superfamily[J]. Science，1995，270：1354-1357.

[5] Burney RO， Giudice LC. Pathogenesis and pathophysiology of endometriosis[J]. Fertil Steril，2012，98：511-519.

[6] 謝幸，茍文麗，林仲秋，等.婦產科學[M].8版.北京：人民衛生出版社，2013：268-274

[7] Hall JM， Korach KS. Stromal cell-derived factor 1， a novel target of estrogen receptor action， mediates the mitogenic effects of estradiol in ovarian and breast cancer cells[J]. Mol Endocrinol，2003，17：792-803.

[8] Johnson AB， O'Malley BW. Steroid receptor coactivators 1， 2， and 3： Critical regulators of nuclear receptor activity and steroid receptor modulator（srm）-based cancer therapy[J]. Mol Cell Endocrinol，2012，348：430-439.

（收稿日期：2016-10-26）