四環(huán)素耐藥基因在養(yǎng)豬場(chǎng)豬糞和土壤中的分布研究

任雪麗+嚴(yán)劍芳+王曉慧+張明+徐佳麗+江濤

摘 要：該文采用PCR方法研究了養(yǎng)豬場(chǎng)中豬糞和土壤中耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌（TR-LFE）中的tet-R分布和多樣性。結(jié)果表明，在分離的258株耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌中，共檢測(cè)到191株含有tet-R基因，占74.03%。各樣品的耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌中tet-R基因的檢出率范圍為3.12%～96.87%。根據(jù)檢出頻率的大小，各類tet-R基因的排列順序?yàn)椋簍et（A），tet（B），tet（M），tet（G），tet（C），tet（D），tet（S），所有樣品都沒有檢測(cè)到tet（O）和tet（X）。

關(guān)鍵詞：耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌；四環(huán)素耐藥基因；豬糞；土壤

中圖分類號(hào) S815 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）07-13-03

Abstract：In this paper，PCR was applied to analyze the distribution and diversity of tetracycline resistant genes（tet-R gene）in tetracycline resistant Lactose-fermenting Enterobacteriaceae（TR-LFE） separated from swine manure and soil in hoggery.The research results showed that 191 of the 258 strains of TR-LFEs were detected to be tet-R gene positive，accounting for 74.03%.The rates of tet-R gene positive TR-LFE were in the range of 3.12%～96.87%.Based on the detection frequency of tet-R genes，the general rank of tet-R genes was set out as follows： tet （A），tet （B），tet （M） and tet （G） and tet （C） and tet （D） and tet （S）.All the samples were not detected to be tet （O） and tet （X）.

Key words：Tetracycline resistant Lactose-fermenting Enterobacteriaceaer；Tetracycline resistant genes livestock feces；Pig manure；Soil

1 前言

自Pruden等[1]第一次將抗性基因作為一種新興的環(huán)境污染物提出以來，抗性基因在全球范圍內(nèi)引起了廣泛的關(guān)注。隨著人類對(duì)抗生素的需求日益增加，抗性基因的污染問題日益加重。抗生素是人類抵御細(xì)菌感染類疾病的武器，一旦致病菌獲得這些耐藥基因，就會(huì)形成“超級(jí)細(xì)菌”，它幾乎可以抵御所有的抗生素。如2011年德國(guó)暴發(fā)了蔓延了歐洲9個(gè)國(guó)家的“毒黃瓜”事件，是由一種新型的高傳染性有毒菌株-O104：H4血清型腸桿菌出血性大腸桿菌引起的，該菌株攜帶氨基糖苷類、大內(nèi)環(huán)酯類、磺胺類等抗生素耐藥基因，因抗生素治療無效，而導(dǎo)致33人確認(rèn)死亡，3 000多人受到感染，至少470人出現(xiàn)腎功能衰竭并發(fā)癥[2]。

目前已發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素類抗性基因的種類達(dá)到40種以上，此外還有4種磺胺類抗性基因和10種β-內(nèi)酰胺類抗性基因。抗生素被用來預(yù)防和治療動(dòng)物疾病以及用作動(dòng)物促生長(zhǎng)劑，四環(huán)素作為一種廣譜抗生素廣泛用于禽畜養(yǎng)殖業(yè)[3]。抗生素進(jìn)入人或動(dòng)物體內(nèi)，會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性菌株[4]，其中25%～75%的抗生素以原態(tài)或絡(luò)合態(tài)的形式排出體外[5]，這些抗生素隨糞便進(jìn)入到環(huán)境中，會(huì)對(duì)環(huán)境中的微生物產(chǎn)生選擇壓力，誘導(dǎo)其產(chǎn)生大量的抗生素抗性基因[6]。本文通過普通PCR方法研究了養(yǎng)豬場(chǎng)豬糞和土壤中耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌（TR-LFE）中的tet-R分布和多樣性。

2 材料與方法

2.1 樣品采集 本次實(shí)驗(yàn)的樣品采自上海市松江區(qū)某養(yǎng)豬場(chǎng)的新鮮公豬豬糞（GZ）、母豬豬糞（MZ）和養(yǎng)豬場(chǎng)內(nèi)的蔬菜種植地的土壤（TR）。采樣時(shí)間為分別為2014年9月、11月和2015年1月。

2.2 菌株分離 乳糖發(fā)酵型腸桿菌（LFE）采用麥康凱培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌（TR-LFE）參見文獻(xiàn)[7]。

2.3 PCR實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分離出258株耐四環(huán)素LFE。采用水煮法提取全細(xì)胞DNA，方法參見文獻(xiàn)[7]。本實(shí)驗(yàn)采用9種不同的目標(biāo)引物進(jìn)行普通PCR檢測(cè)，檢測(cè)的目的基因?yàn)椋簍et（A）、tet（B）、tet（C）、tet（D）、tet（G）、tet（M）、tet（O）、tet（S）和tet（X）。PCR反應(yīng)體系和方法參見文獻(xiàn)[7]。

3 結(jié)果與分析

3.1 TR-LFE中（tet-R）基因陽性菌株的數(shù)量統(tǒng)計(jì) 采用普通PCR技術(shù)對(duì)選取TR-LFE攜帶的四環(huán)素耐藥基因進(jìn)行了檢測(cè)，得出其分布情況。研究結(jié)果：分別統(tǒng)計(jì)了9月67株（GZ：35株；MZ：32株）；11月96株（GZ：32株；MZ：32株；TR：32株）；1月95株（GZ：31株；MZ：32株；TR：32株）。在檢測(cè)的258株TR-LFE中，255株為tet-R基因陽性菌，即至少攜帶1種或2種tet-R基因，占據(jù)檢測(cè)菌株總數(shù)的74.03%。從圖1可以看出，GZ和MZ分離出的菌株含tet-R基因的菌株所占的比例明顯多于其他樣品中的比例，范圍在78.12%～96.87%。Andrew Bryan等[8]在分離325株高耐藥性（耐95μg/mL四環(huán)素）的大腸桿菌中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，97%的菌株至少帶一種tet-R基因。他們檢測(cè)的tet-R基因有14種，分別是：tet（A），tet（B），tet（C），tet（D），tet（E），tet（G），tet（K），tet（L），tet（M），tet（O），tet（S），tetA（P），tet（Q）和tet（X）。TR中含tet-R基因的菌株在11月份和1月份的比例分別是25.00%和46.88%，與豬糞樣品相比，其比例降低了近50%。

由表3得出，1月份的5個(gè)樣品中的TR-LFE中出現(xiàn)的tet-R基因檢出的情況與前2個(gè)月份差異較大。不管是檢出頻率還是檢出的基因數(shù)都顯著下降。檢出基因只有：tet（A）、tet（B）、tet（G）、tet（M）。與9月份的情況相同的是，tet（A）和tet（B）在GZ中有較高的檢出率。

綜上所述，豬糞的TR-LFE中檢測(cè)到的基因種類最多，有tet（A）、tet（B）、tet（C）、tet（D）、tet（M）、tet（S）。TR的TR-LFE中出現(xiàn)過3種基因，都為tet（A）、tet（B）和tet（G）。tet（A）在所有樣品的TR-LFE中都有檢測(cè)到，檢測(cè)率最高，tet（B）次之。這與Al-Bahry SN[9]和Roberts[10]等的研究結(jié)果基本吻合；Tao等 [11]在研究珠江水樣中tet-R基因時(shí)也發(fā)現(xiàn)tet（A）和tet（B）廣泛分布于珠江分離的大腸桿菌中，而tet（C）和tet（D）僅在珠江的幾個(gè)采樣點(diǎn)的菌株中有檢測(cè)到。類似地，本實(shí)驗(yàn)tet（C）和tet（D）分別僅出現(xiàn)在11月份的GZ和9月份的MZ的TR-LFE中檢測(cè)到。tet（G）在11月份和1月份的TR中有檢測(cè)到，未在豬糞樣品中檢測(cè)到。tet（M）主要在豬糞中檢測(cè)到，幾乎每個(gè)季度的豬糞中的TR-LFE都有檢測(cè)到。而tet（S）則僅出現(xiàn)在9月份和11月份的GZ中。能編碼核糖體保護(hù)蛋白的tet（O）常常由質(zhì)粒介導(dǎo)，已在一些鏈球菌和腸球菌中被發(fā)現(xiàn)；tet（X）能編碼一種氧化還原酶，能在有氧和NADPH存在的情況下將四環(huán)素滅活[9]，而本實(shí)驗(yàn)所有樣品中都沒檢測(cè)到tet（O）和tet（X）。

4 討論

從養(yǎng)豬場(chǎng)豬糞和土壤中分離的258株TR-LFE中，共檢測(cè)到191株含有tet-R基因，占74.03%。各樣品的乳糖發(fā)酵型腸桿菌中tet-R基因的檢出率范圍為3.12%～96.87%。根據(jù)檢出頻率的大小，各類tet-R基因的排列順序?yàn)椋簍et（A），tet（B），tet（M），tet（G），tet（C），tet（D），tet（S）。所有樣品的TR-LFE中都未檢測(cè)到編碼核糖體保護(hù)蛋白的tet（O）和tet（X）。tet（A）和tet（B）是所有樣品中TR-LFE中最主要、檢出率最大的基因型。

參考文獻(xiàn)

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