發生在鐵皮石斛栽培田中的2種“黏菌病”

屠艷拉， 肖芳， 張敬澤*， 盧啟強, 汪樂福

(1.浙江大學農業與生物技術學院生物技術研究所,杭州 310058；2.樂清市農業局，浙江 樂清 325600)

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發生在鐵皮石斛栽培田中的2種“黏菌病”

屠艷拉1,2， 肖芳1， 張敬澤1*， 盧啟強2, 汪樂福2

(1.浙江大學農業與生物技術學院生物技術研究所,杭州 310058；2.樂清市農業局，浙江 樂清 325600)

摘要2011年在浙江省樂清市鐵皮石斛栽培田中發現了2種“黏菌病”，它們影響植株的正常生長。通過光學顯微鏡、超微結構觀察、孢子萌發試驗和18S核糖體序列比較分析，它們分別被鑒定為美發菌[Comatricha pulchella (C. Bab.) Rostaf.]和煤絨菌[Fuligo septica (L.) Wigg.]。美發菌子實體較小，具柄，高度大約2.2 mm，孢囊圓柱形，密集的產生在植物莖、葉表面。煤絨菌整個子實體是一個大型的復囊體，墊形到不規則形，長達15 cm，子實體可覆蓋整個植株叢。這2個種都是浙江新記錄種。該發現補充了浙江菌物資源，亦為中國黏菌地理分布和多樣性研究積累了基礎資料。

關鍵詞美發菌； 煤絨菌； 新記錄種； 浙江省

Two “myxomycete diseases” occurred on cultivated fields of Dendrobium candidum.JournalofZhejiangUniversity(Agric. &LifeSci.), 2016,42(2):137-142

TU Yanla1,2, XIAO Fang1, ZHANG Jingze1*, LU Qiqiang2, WANG Lefu2

(1.InstituteofBiotechnology,CollegeofAgricultureandBiotechnology,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China; 2.AgricultureBureauofYueqingCity,Yueqing325600,Zhejiang,China)

SummaryDendrobiumCandidum(Orchidaceae) is an aerophyte cultivated widely in Zhejiang Province as traditional Chinese herbal medicine. Two “myxomycete diseases”, which affected the growth of plants, were found in cultivated fields ofD.candidumin Yueqing City of Zhejiang Province in 2011. Two “pathogens” were identified asComatrichapulchella(C. Bab) Rostaf. andFuligoseptica(L.) Wigg. by morphological characters and molecular data, including light microscopy, scanning electron microscopy, spore germination and analysis of 18S rDNA sequences. Sporocarps ofC.pulchellawere stipitate and gregarious, with about 2.2 mm in total height and cylinder-shaped sporangia, intensively distributed on the plant stem and leaf surface; its dense capillitium arose from the entire columella and dark spores in mass (7.2-8.0 μm in diameter). Whereas, the sporocarp ofF.septicawas a large scale cushion-shaped or irregular type aethalium, with up to 15 cm in length and the colors of the outer peridium in the spore-bearing stage, which could cover the whole cluster of the plants. White, stipitate and young sporangia were observed on young leaves and stems ofD.Candidumafter 15 d of inoculation withC.pulchella, and the mature sporangia were observed after 20 d of inoculation. Whereas, no sporocarp was observed on young leaves and stems ofD.Candidum, but yellowish sporocarps produced on the substrate near the root after 15 d of inoculation withF.septica; with development of the sporocarp, the color became opalescent, and large sporocarps were observed after 30 d of inoculation, which covered the basal part of stems. The artificial inoculation results showed that both the myxomycetes could not infect the living plants. To the best of our knowledge, the two species both were the new record in Zhejiang Province. The discovery ofC.pulchellaandF.septicaenriches the fungal resources of Zhejiang Province and also provides fundamental materials to further study on geographical distribution and diversity of myxomycete in China.

Key wordsComatrichapulchella(C. Bab.) Rostaf.;Fuligoseptica(L.) Wigg.; new record species; Zhejiang Province

黏菌(myxomycete， plasmodial slime molds)是主要在土表和雜草中取食原生生物、細菌和真菌的土壤變形蟲。它們廣泛存在，已描述的分類單元超過1 000個[1]。黏菌以復雜的生活史為特征，可分為二倍體和單倍體階段。2個單倍體變形蟲鞭毛體融合形成一個二倍體原生質團，在某個時候，隱藏的原生質團從土壤里重浮出表面，擴展到碎石或下部分枝或其他植被，在植物表面形成子實體；原生質體能達到明顯的大小，產生子實體位點的表面可能被覆蓋半透明到奶油色或淡黃色黏液[2]；子實體變干，釋放孢子不是通過機械機制，就是通過風、雨、昆蟲等被動機制。

黏菌子實體能覆蓋在大部分植物的下部。白柄菌(Diachealeucopodia)和法網黏菌科(Stemonitaceae)的種發生在波蘭草莓新葉和老葉上；煤絨菌(Fuligoseptica)、復囊鈣皮菌(Mucilagospongiosa)和灰絨泡菌(Physarumcinereum)在北美草坪上均有發現[3-4]。最近，在亞熱帶草本植物的花序上也發現了一些黏菌。ZHANG等[5]發現在浙江紹興鐵皮石斛(DendrobiumCandidum)種植田中有淡黃絨泡菌(Physarummelleum)發生。雖然黏菌不會像真菌病原菌侵染寄主，但是其覆蓋在活的植物表面或整個植物上顯然會影響植株的生長；因此，我們仍把這種危害稱為“黏菌病”。

鐵皮石斛為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，為我國傳統的名貴中藥材，2010年版《中國藥典》專門列為單一品種的中藥材，它在浙江廣泛種植。2011年，我們在浙江樂清市雁蕩山地區鐵皮石斛栽培田中發現了另外2種黏菌，它們生長或覆蓋鐵皮石斛植株，其中一種子實體小型、具柄，而另外一種大型，呈墊狀復囊體。本文主要描述了這2個黏菌引起的“病害”癥狀，并依據細胞學、超微結構特征和分子數據鑒定這2個黏菌，這將為我國黏菌地理分布、多樣性及其資源調查和研究提供基礎信息。

1材料與方法

1.1癥狀和形態學特征觀察

黏菌的觀察和標本采集在浙江省樂清市雁蕩山地區鐵皮石斛種植基地。雁蕩山為國家重點風景名勝區，地理坐標為121°10′ E，28°36′ N，海拔1 000 m，處于海洋季風氣候生態環境中。田間黏菌觀察于2011年7—9月進行。將具有黏菌的鐵皮石斛植株或黏菌子實體帶回實驗室，進一步用于觀察和分析。

形態學觀察和攝影。黏菌子實體觀察、大小測量和攝影在SMZ1500解剖鏡(尼康公司，日本)下進行。該解剖鏡具有數字化視野的DS-fil攝像頭和NIS-Elements 3.22數字成像軟件。至少測量100個子實體，包括柄、囊軸和孢囊的大小等。孢子、彈絲等形態觀察和攝影在具有Axiocam CCD攝像頭和Axiovision 3.1數字成像軟件的Axiophot 2顯微鏡(ZESS公司，德國)下進行，至少測量100個孢子。

在地方層面，上中下游涉及到11個省市，不同省市經濟發展程度與沿岸的捕撈漁業、漁村、漁民情況不同，其面臨的水生生物尤其是魚類資源問題差異比較大，導致各地重視程度、治理效果差異也比較大。由于涉及部門多、省市多，缺乏既專業、系統，又全面、協調的綜合治理機制，難以提高治理的協同效果。

原生質團的觀察。挑取子實體中的孢子配制成孢子懸浮液(1×106個/mL)，取50 μL孢子懸浮液于滅過菌的凹玻片上，然后放入墊有濕潤濾紙的培養皿中，在黑暗條件下于25 ℃恒溫箱中培養，定期觀察孢子產生原生質體的狀態。

1.2超微結構觀察

用刀片切取有黏菌的組織，放入4%戊二醛磷酸緩沖液中，在4 ℃冰箱中固定24 h，用磷酸緩沖液(pH 7.0)沖洗后，將樣品用濾紙隔開進行臨界點干燥。干燥后的樣品用膠紙粘在銅臺上，進行鉑金噴鍍，然后在Philips XL30掃描電鏡(FEI公司，美國)下觀察，拍照。

1.3DNA提取、擴增和測序

分別把具柄的黏菌子實體或墊狀復囊體放置在干凈的載玻片上，用鑷子破碎子實體，移掉碎片，獲得大量孢子。將孢子(約0.2 mg)轉移到離心管中，加入溴化十六烷基三甲銨(cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB)緩沖液[6]，用玻璃研磨杵研磨。在顯微鏡下檢查孢子破裂程度，然后提取DNA[6]。設計多個18S小亞基(small subunit, SSU) rDNA引物[7]，由上海生工生物工程有限公司合成。擴增循環[8]，退火溫度依據引物不同，溫度范圍從50到53 ℃，延伸時間1～2 min。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測和比較，最大的片段用于測序。產物連接根據說明書(pGEM-T-Easy Vector System 1, Promega公司，美國)進行。測序由上海桑尼生物科技有限公司完成。

1.4序列分析

測序后的序列用Bio-Edit軟件[9]進行編輯和比較分析，然后在GenBank數據庫中用Blast工具進行高度相似的序列搜索，并用ClustalX 1.81軟件[10]進一步進行序列比較分析。

1.5人工接種

2結果

2.12種“黏菌病”的癥狀

在鐵皮石斛栽培田中有2種黏菌發生：一種黏菌的子實體是有柄的圓柱形孢囊(圖1A，B)；另外一種黏菌具有大的子實體，是墊狀復囊體(圖2A～C)。

前者子實體很小，生長在活體植物的莖、葉上。子實體初為白色，散布在寄主表面呈粒狀小點(圖1A)，隨后呈乳白色。成熟的子實體呈暗褐色，肉眼觀察如同覆蓋了一層黑褐色霉層(圖1B)。由于栽培鐵皮石斛常將3～5個植株作為1穴，一些穴中個別植株上有黏菌子實體的分布，偶爾個別穴中所有植株上都覆蓋著黏菌子實體。

后者子實體很大，腐生在栽培田中的基質上，或覆蓋在整穴鐵皮石斛植株上。如果子實體發育很大，1穴植株僅有幾個葉片外露(圖2A)，或整穴植株被完全覆蓋(圖2B)。由于黏菌子實體遮蔽了植物生長需要的光照(圖2C)，阻礙了植株的光合作用，導致植株矮化。

2.2形態學鑒定結果

在小型黏菌中，成熟的子實體具柄，孢囊群生，有時密集。早期呈卵形至倒棒形(圖1A)，成熟至圓柱形，暗褐色(圖1B)，長1.2～2.0 mm(平均1.6 mm)，寬0.3～0.4 mm(平均0.33 mm)，整個高度1.8～2.6 mm(平均2.2 mm)。囊被早期為白色，并逐漸脫落(圖1C，D)。柄呈紫黑色，長0.6～0.7 mm(平均0.65 mm)，不超過全高的1/2(圖1D)。囊軸向上漸細，延伸至孢囊頂端，最終融合成孢絲(圖1E)。孢絲密集，分枝并聯結形成內網，初級分枝與囊軸成直角，尖端色淡，游離末梢較少(圖1F)。孢子球形，直徑為7.2～8.0 μm(平均7.5 μm)，成堆時呈褐色，在光學顯微鏡下呈淺紫褐色，表面有均勻小疣(圖1H)。孢子萌發后產生乳白色的黏變形體(圖1G)。依據這些形態學特征，該種被鑒定為美發菌[Comatrichapulchella(C. Bab.) Rostaf.]，正如其他學者對該分類單元的描述[11-12]。

在大型黏菌中，子實體是大型的復囊體。復囊體呈枕狀，乳白色，通常較大，寬2～4 cm，厚2.4～2.8 cm，長達15 cm，有時在乳白色中含有微紅色區域(圖2A～C)。其皮層具石灰質，厚而脆，易脫落。復囊體內含有大量的孢子，孢子成堆時呈黑褐色(圖2D)，在光學顯微鏡下呈紫褐色，孢子球形，直徑6.3～7.2 μm(平均6.8 μm)，表面具細刺。孢絲分散在孢子堆中，孢絲具有石灰結，呈白色，連接線無色。孢子萌發后產生白色的黏變形體。依據這些形態學特征，該種被鑒定為煤絨菌[Fuligoseptica(L.)Wigg.]，與其他學者[11-12]對該種的描述相符。

2.3rDNA序列分析結果

從小型黏菌中擴增到500～600 bp的片段，最長的片段經測序后獲得610 bp的18S rDNA序列。用Blast在GenBank數據庫中搜索顯示，該序列與一個未培養的發菌屬(Comatrichasp.)中的種同源性達到98%(GenBank登錄號：JQ900836)[13]。結合形態學特征，進一步確定該種為美發菌[Comatrichapulchella(C. Bab.) Rostaf.]。

從大型黏菌中擴增到450～560 bp的片段，最長的片段經測序后獲得567 bp的18S rDNA序列。Blast搜索結果顯示，該序列與煤絨菌黃色變種(Fuligosepticavar.flava)同源性達到99%(GenBank登錄號：KP323378)。序列分析結果進一步確定該種為煤絨菌[Fuligoseptica(L.) Wigg.]。

2.4人工接種結果

人工接種美發菌10 d后，在鐵皮石斛莖、葉上產生白色有柄的幼孢子囊(圖3)。20 d后，有成熟的孢子囊產生，正如前文所述。用水沖洗或移掉子實體后，在產生子實體位點處的植物組織仍然是健康的。

A：在鐵皮石斛葉和莖表面的白色有柄的幼孢子囊；B：在鐵皮石斛莖表面的褐色有柄的成熟孢子囊；(C～D)：解剖鏡下單個或成群的孢子囊；E：孢子囊掃描電鏡圖；F：產生于囊軸上的、具有形成內網孢絲端分枝的孢絲；G：萌發孢子產生的無色的黏變形體；H：在掃描電鏡下顯示為鈍的疣突的孢子紋飾。A: Young white stalked sporangia on leaves and stems of Dendrobium candidum; B: Mature brown stalked sporangia on stems of D. candidum; (C-D): Single or groups of sporangium under dissecting microscope; E: Scanning electron microscopy of sporangia; F: Branched capillitia arising from the columella, and the capillitial heads forming an interior network; G: A white myxamoeba produced from a germinated spore; H: Spore ornamentation with blunt warts observed under the scanning electron microscope.圖1　美發菌的光學和掃描電鏡圖Fig.1　Light microscopy and scanning electron microscopy of Comatricha pulchella

(A～B)：不同大小和形狀的白色復囊體；C：覆蓋在一簇鐵皮石斛植株上的復囊體；D：復囊體皮層脫落后形成的黑褐色的孢子堆；E：萌發孢子產生的透明的黏變形體。(A-B): Aethalia of different sizes and shapes; C: Aethalia covered on clusters of D. candidum plants; D: A black brown sorus formed after white thickened cortex of aethalia peeling off; E: A transparent myxamoeba produced from a germinated spore. 圖2　煤絨菌的光學顯微圖Fig.2　Light microscopy of Fuligo septica

接種煤絨菌孢子懸浮液15 d后，在鐵皮石斛的莖、葉上沒有觀察到黏菌子實體的形成，但在鐵皮石斛根周圍的基質上產生了淡黃色的子實體。隨著發育，相鄰的小子實體聚合成更大的子實體。30 d后，隨著體積增大，子實體逐漸變成蒼白色到乳白色。大的子實體覆蓋莖基部，但與植物接觸的部位植物組織仍然是健康的。人工接種結果表明，2個黏菌都不能侵染植物。

圖3　接種10 d后在鐵皮石斛莖、葉上產生的白色有柄的美發菌幼孢子囊Fig.3　Young white stalked sporangia of C. pulchella produced on stems and leaves of D. candidum after 10 d of inoculation

3討論

黏菌屬于腐生菌，不是致病菌。但黏菌確實能影響植物的生長。本文提供了黏菌影響植物生長的實例。美發菌是腐生菌，罕見發生在活樹的樹皮上[11]，而我們首次觀察到了該種生長在活的植物莖、葉上的證據。煤絨菌是最普通的黏菌，子實體除發生在活的樹和藤上外，幾乎能在任何東西上發現，而巨大的子實體覆蓋整個植物，顯然影響植物生長。COUCH[2]對覆蓋在植物葉片的黏菌稱為“病害”，我們這里稱“黏菌病”，是指黏菌對植物生長造成的不利影響。

黏菌半透明或透明的原生質覆蓋在植物上，很有可能干擾植物光合作用、蒸騰作用和呼吸作用；通過改變植物正常生理機制，從而影響葉綠體含量，妨礙自由氣體交換，改變氣孔關閉程序等[2]。黏菌影響植物的正常生長，不及時清除，孢子還會隨著風、雨等的傳播附著在其他健康的植株上。“黏菌病”的發生與特定環境密切相關。模擬自然環境栽培鐵皮石斛，基質通常由樹皮、泥炭、刨花和石塊混合構成。黏菌以吞噬有機物、細菌或小的原生生物作為營養。由于基質主要成分是樹皮，在潮濕環境條件下含有大量腐爛的有機物和微生物，有利于黏菌的生長，易于“黏菌病”的發生。因此，在鐵皮石斛生產上控制基質的濕度，是防治“黏菌病”發生的重要措施之一。

對黏菌種的分類目前仍然僅依據形態學特征[13]。但僅依據形態學建立的種存在明顯的缺陷，如分類可用的分類特征較少，種的建立基于少量的標本，采用不穩定的特征等，這些將造成分類單元含有隱蔽種或復合種存在。隨著黏菌分子系統學的發展，主要基于SSU rRNA和延長因子α1序列[14-15]進行分類，這2類基因能在不同水平上很好地反映黏菌的系統發育關系。然而，延長因子α1基因太保守而不能提供充分的位點信息[16-17]，主要用于較高分類序級。因此，SSU rRNA基因被廣泛應用于相對較低的黏菌類群分類[8,16-18]上。黏菌18S rDNA基因具有多個大的內含子，有時具有強的次生結構，需要用引物步移法(primer walking method)進行擴增[8]。在設計的多個引物[7]中，幾個引物僅匹配1個序列，且常在內含子中。本研究結果顯示，18S rDNA序列在黏菌屬水平上是非常有用的，對分類單元的鑒定可達到種的水平，如文中的煤絨菌。然而，由于數據庫中測序黏菌種類的限制，如美發菌還沒有相應序列可以參考，還有待大量數據進一步比較證實，我們的結果可為其提供有用的信息。

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中圖分類號Q 939.5

文獻標志碼A

收稿日期(Received)：2015-06-09；接受日期(Accepted)：2015-09-23；網絡出版日期(Published online)：2016-03-20

*通信作者(

Corresponding author)：張敬澤(http://orcid.org/0000-0001-8604-8280)，E-mail:jzzhang@zju.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金(31571950).

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1247.S.20160321.1424.008.html