云煙87突變體新品系的特征特性及其DNA指紋圖譜鑒定

陳婷婷， 李顯富， 賈春雷， 安雪琴， 朱俊， 肖立增， 戴秀梅， 張建奎*

(1.西南大學煙草科學研究所/重慶煙草科學研究所/南方山地農業教育部工程研究中心，重慶 400715；

2.貴州省煙草公司銅仁市公司，貴州 銅仁 554300)

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云煙87突變體新品系的特征特性及其DNA指紋圖譜鑒定

陳婷婷1， 李顯富2， 賈春雷1， 安雪琴2， 朱俊1， 肖立增1， 戴秀梅1， 張建奎1*

(1.西南大學煙草科學研究所/重慶煙草科學研究所/南方山地農業教育部工程研究中心，重慶 400715；

2.貴州省煙草公司銅仁市公司，貴州 銅仁 554300)

摘要為進一步提高目前生產上推廣面積最大的烤煙品種云煙87的產量和品質，從云煙87自然變異群體中經系統選擇育成2個突變體新品系T24和凹葉煙，對其特征特性進行鑒定，為其生產應用和品種鑒別與保護提供依據。田間試驗以主栽烤煙品種云煙87和K326為對照，對T24和凹葉煙的植物學性狀、農藝性狀、產量和品質進行鑒定；利用簡單重復序列(simple sequence repeat, SSR)分子標記，構建T24、凹葉煙及與其親緣關系較近的云煙87、K326及其突變系片片黃、云煙97及其突變系M97-1、烤煙新品系09-1和客田煙共9個品種(系)的DNA指紋圖譜。結果表明：1)T24和凹葉煙的株型、植物學特征及大田生育期與云煙87相似，但有效葉片數、葉片長寬、莖圍、株高都超過了云煙87；兩者的產量分別為2 247.38和2 195.62 kg/hm2，產值為53 657.56和52 586.47元/hm2，上中等煙率為90.59%和90.38%，均高于對照；兩者的煙葉還原糖、總糖、淀粉、總植物堿含量等均達到優質煙葉標準；感官評吸評價T24為80.0分，高于云煙87(76.3分)和K326(77.7分)，凹葉煙為75.3分。2)從14對SSR的核心引物中篩選出重復性好、多態性好、品種鑒別效率高的4對引物PT20213、PT30028、PT30224、PT30399，在T24、凹葉煙、云煙87、K326等9個品種中擴增出了18條多態性條帶；選擇其中7個譜帶構建了這9個煙草品種的指紋數據庫，據此繪制了DNA指紋圖譜，建立了這9個品種的鑒別流程，即用至少3對引物可將這9個品種完全鑒別開。上述結果表明：T24的產量和品質均優于云煙87，具有良好的生產應用潛力；構建的參試品種的特異性指紋圖譜，可作為品種鑒別的依據。

關鍵詞烤煙(Nicotiana tabacum L.)； 選擇育種； 云煙87； 突變體； DNA指紋圖譜

Characteristics of new flue-cured tobacco strains developed from Yunyan87 mutants and their DNA fingerprint identification.JournalofZhejiangUniversity(Agric. &LifeSci.), 2016,42(2):179-189

CHEN Tingting1, LI Xianfu2, JIA Chunlei1, AN Xueqin2, ZHU Jun1, XIAO Lizeng1, DAI Xiumei1, ZHANG Jiankui1*

(1.TobaccoScienceResearchInstitute/ChongqingTobaccoScienceResearchInstitute/EngineeringResearchCenterofSouthUplandAgriculture,MinistryofEducation,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China; 2.TongrenBranchofGuizhouTobaccoCorporation,Tongren554300,Guizhou,China)

Summary Yunyan87 was a flue-cured tobacco variety with largest-scale cultivation in China. To further improve the yield and quality of Yunyan87, two new mutant strains named T24 and Aoyeyan were developed from the natural mutants of Yunyan87 using selection breeding method. The characteristics and DNA fingerprint of the two new mutant strains were identified to provide basis for variety application, identification and protection.

The field tests were performed to identify the botanic characters, agronomic characteristics, yield and quality of T24 and Aoyeyan in Tongren City of Guizhou Province from 2011 to 2013, using the leading flue-cured tobacco cultivars Yunyan87 and K326 as control varieties. Furthermore, simple sequence repeat (SSR) molecular marker technology was used to establish the DNA fingerprint maps of T24, Aoyeyan and their genetically related varieties Yunyan87, K326, Yunyan97 and four new mutant lines and strains (M97-1, Pianpianhuang, 09-1, Ketianyan), altogether nine accessions.

The results were as follows: 1) The botanic characteristics, plant shape and growth duration in field of T24 and Aoyeyan were similar with Yunyan87, but their effective leaf numbers, leaf length and width, stem circumference, plant height all exceeded Yunyan87. The yields of T24 and Aoyeyan were 2 247.38 and 2 195.62 kg/hm2, with production value of 53 657.56 and 52 586.47 Yuan RMB/hm2, and the rates of superior and middle grade leaves were 90.59% and 90.38%, respectively, which all exceeded control varieties。 The contents of reducing sugar, total sugar, starch, total plant nicotine of T24 and Aoyeyan were all up to the high quality standard of flue-cured tobacco leaves. The sensory taste score of T24 was 80.0, higher than Yunyan87 and K326, with scores of 76.3 and 77.7, respectively. The sensory taste score of Aoyeyan was 75.3. 2) Four SSR primers,i.e. PT20213, PT30028, PT30224 and PT30399 were selected from 14 core primers, which gave stable and polymorphic amplification profiles and had efficient identification ability to tobacco varieties. Eighteen polymorphic DNA fragments of all nine varieties including T24, Aoyeyan, Yunyan87, K326, Yunyan97, M97-1, Pianpianhuang, 09-1, Ketianyan were amplified, among which seven specific bands were selected to encode the fingerprint database. Fingerprint map of the nine varieties were drawn according to the fingerprint database. Each variety had a distinctive fingerprint map, therefore could be identified each other by at least three SSR primers, and the identification process of the nine varieties was established.

In conclusion, the yield and quality of T24 are higher than Yunyan87, so T24 has a great application potential. The distinctive fingerprint map of the tested varieties can provide basis for the variety identification and protection.

Key wordsflue-cured tobacco (NicotianatabacumL.); selection breeding; Yunyan87; natural mutant; DNA fingerprint map

優良品種是煙葉產量和質量的基礎，自然變異選擇育種是煙草育種的有效方法。云煙87是以云煙二號為母本、K326為父本雜交選育而成的，2000年通過國家煙草品種審定，在全國推廣10多年，目前仍是全國種植面積最大的烤煙品種，但是其產量和質量仍有待于進一步提高。本研究組從貴州省銅仁市煙農種植的云煙87煙田中選擇變異單株，經純系選擇、品比試驗、區域試驗、生產試驗，選育出了2個突變體新品系，分別命名為T24和凹葉煙。

不管是從品種保護的角度，還是從品種推廣應用的角度，對品種的準確鑒定都非常重要。依據傳統的形態學特征進行品種鑒定，容易受到環境與主觀因素的影響，鑒定不穩定，可靠性低，不僅增加了鑒定的難度，而且容易錯亂。以分子標記為基礎的DNA指紋鑒定技術具有準確、簡單快速、易于自動化的優點，通過構建DNA指紋圖譜進行品種快速鑒定已成為一種發展趨勢，在玉米[1]、水稻[2]、小麥[3]、番茄[4]、馬鈴薯[5]、甘薯[6]、棉花[7]等多種作物上都有應用，而關于煙草品種的DNA指紋圖譜鑒定還不成熟[8-9]。本研究以云煙87和另一個大面積生產種植品種K326作為對照，對突變體新品系T24和凹葉煙的農藝性狀、產量和品質進行鑒定，并利用簡單重復序列(simple sequence repeat, SSR)分子標記構建了T24、凹葉煙、云煙87、K326等9個品種的DNA指紋圖譜，建立了這些品種的鑒別流程，旨在為新品種生產應用、鑒別和保護提供科學依據。

1材料與方法

1.1供試材料

田間試驗材料為從云煙87中選育的2個突變體新品系T24和凹葉煙，以我國南方主栽烤煙品種云煙87和K326作為對照。構建DNA指紋圖譜的材料還包括K326的突變系片片黃、云煙97及其突變系M97-1、烤煙新品系09-1和客田煙。

1.2農藝與品質性狀鑒定方法

1.2.1田間試驗設計

田間鑒定試驗于2011—2013年連續3年在貴州省銅仁市松桃縣大興鎮進行，試驗地海拔730 m，土壤類型為黃泥土，土地平整，肥力均勻，pH 5.53，含有機質24.02 g/kg，銨態氮19.93 mg/kg，硝態氮20.61 mg/kg，速效磷11.22 mg/kg，速效鉀45.12 mg/kg。試驗采用隨機區組設計，3次重復，行距1.2 m，株距 0.5 m，每小區6行，每行16株，小區面積57.6 m2。

1.2.2性狀調查鑒定方法

1)農藝性狀調查方法：根據《煙草農藝性狀調查方法》(YC/T 142—2010)，調查株高、莖圍、節距、腰葉長、腰葉寬、有效葉數、大田生育期、株型、葉形、葉耳、葉面、葉尖、葉緣等植物學與農藝性狀指標。

2)經濟性狀調查方法：按生產常規成熟采收標準和烘烤技術，分小區采收、烘烤，按中國煙草行業現行烤煙分級標準《烤煙》(GB 2635─1992)進行煙葉分級和稱量，計算單位面積產量、產值、均價、上中等煙比例等經濟指標。

3)煙葉品質鑒定方法：對打頂煙株從下往上數的第9～13位葉片進行掛牌標記，烘烤后的原煙送中國農業科學院煙草研究所農業部煙草產業產品質量監督檢驗測試中心進行煙葉外觀和物理性狀、化學成分、感官評吸品質鑒定。

化學成分測定指標包括還原糖、總糖、淀粉、總植物堿、總氮、鉀、氯，用連續流動法測定，檢測依據是《煙草及煙草制品 水溶性糖的測定 連續流動法》(YC/T 159—2002)、《煙草及煙草制品 鉀的測定 連續流動法》(YC/T 217—2007)、《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續流動法》(YC/T 160—2002)、《煙草及煙草制品 氯的測定 連續流動法》(YC/T 162—2011)、《煙草及煙草制品 總氮的測定 連續流動法》(YC/T 161—2002)、《煙草及煙草制品 淀粉的測定 連續流動法》(YC/T 216—2007)。

原煙外觀和物理性狀測定指標包括成熟度、身份(油分、厚度、葉片結構)、色澤(顏色、光澤)、單葉質量、含梗率(主脈比例)等，按照《烤煙》(GB 2635─1992)進行。成熟度是指調制后煙葉的成熟程度，包括田間和調制成熟程度，分為完熟(上部煙葉在田間達到高度的成熟，且調制后熟充分)、成熟(煙葉在田間及調制后熟均達到成熟程度)、尚熟(煙葉在田間剛達到成熟，生化變化尚不充分或調制失當后熟不夠)、欠熟(煙葉在田間未達到成熟或調制失當)、假熟(泛指腳葉，外觀似成熟，實質上未達到真正成熟)。煙葉身份指煙葉厚度、細胞密度或單位面積的質量的表現，常以厚度表示，采用《紙和紙板厚度的測定》(GB 451.3—2002)方法進行。煙葉油分是指煙葉組織細胞內含有的一種柔軟的半液體或液體物質，在適宜的含水量情況下，使煙葉外觀反映出的油潤、豐滿、枯燥的充實或貧乏程度，分為多(富油分，表觀油潤)、有(尚有油分，表觀有油潤感)、稍有(較少油分，表觀尚有油潤感)、少(缺乏油分，表觀無油潤感)4個檔次。煙葉葉片結構指煙葉細胞排列的疏密程度，分為疏松、尚疏松、稍密、緊密4個檔次。煙葉顏色分為檸檬黃色(煙葉表觀全部呈現黃色，在習慣稱呼的淡黃、正黃色色域內)、橘黃色(煙葉表觀呈現橘黃色，在習慣稱呼的金黃色、深黃色色域內)、紅棕色(煙葉表觀呈現紅黃色或淺棕黃色，在習慣稱呼的紅黃、棕黃色色域內)。煙葉光澤是指煙葉表面顏色的潔凈度或明暗度，根據顏色對視覺反映的強弱，分為強、較強、中等、弱4個檔次。含梗率(主脈比例)指煙葉主脈質量占單葉質量的比值。

原煙感官品質評價指標包括香型、勁頭、濃度、香氣質、香氣量、余味、雜氣、刺激性、燃燒性、灰色，按照《煙草及煙草制品 感官評價方法》(YC/T 138—1998)和《卷煙 第4部分：感官技術要求》(GB 5606.4—2005)進行。第一步卷制樣品煙支。先調節葉片樣品含水率為16.0%左右，然后進行切絲，再調節煙絲樣品含水率為(12.5±0.5)%，最后采用同一卷煙材料上機卷制評吸樣品煙支。第二步評吸鑒定。評吸在評吸室內進行，室內環境通風，無異味，安靜，無外界干擾，評吸員由9名對煙草及煙草制品感官評價具有豐富經驗的專家級評吸員組成，采用整體循環評吸法評吸。對香氣質、香氣量、余味、雜氣、刺激性、燃燒性、灰色進行定量打分評價，分值分別為15、20、25、18、12、5、5分，總分100分。用最大標度為3～9的等距標度檢驗方法打分，向評吸員提供標準樣品、已編碼的試樣和表格，評吸員按照表格要求對各項指標進行評吸打分，最后將各評吸員的單項評吸結果加和，求其算術平均值，結果保留至1位小數。對香型、勁頭、濃度進行定性評價。烤煙香氣類型按照清香、清香偏中間型、中間偏清香、中間香、中間偏濃香、濃香偏中間香、濃香等7種類型進行分類。其中清香型是指具有突出的清香，吃味舒適，煙味濃度較淡，地方性雜氣比較輕，勁頭柔和至適中；濃香型是指煙葉有突出的濃香，煙味濃厚，吃味舒適，地方性雜氣很輕至較重，勁頭適中；中間香型是介于清香和濃香之間的一種特征香氣類型，吃味干凈，煙味濃度較淡至較濃，地方性雜氣較重，勁頭柔軟至較大。勁頭(又稱為生理強度)是卷煙煙氣(主要是煙堿)對人體產生的生理、心理的刺激程度，分為大、較大、中等、較小、小5個檔次。煙味濃度是指煙氣進入口腔后所感受的濃淡程度，分為大、較大、中等、較淡、淡5個檔次。

1.2.3試驗數據處理方法

應用SAS 9.3軟件按混合模型進行方差分析；采用Tukey方法對不同品種間的差異顯著性進行多重比較；利用Excel 2007對數據進行基本的統計分析，檢測值以平均值±標準誤表示。

1.3DNA指紋圖譜鑒定方法

1.3.1DNA提取

每個品種取7株典型植株的葉片，用改良的溴化十六烷三甲基銨(cetyltrimethyl ammonium bromide, CTAB)法，按單株分別提取基因組DNA。

1.3.2SSR引物篩選

在本實驗室從278對煙草SSR引物[10]中篩選出的14對核心引物[11](表1)的基礎上，進一步篩選PCR擴增帶型清晰、穩定性和重復性好、多態性好、品種鑒別能力強的引物，用于構建參試品種的DNA指紋圖譜。

1.3.3SSR-聚合酶鏈反應擴增程序

聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增總體系為10 μL，包括10×EasyTaq緩沖液(含MgCl2)1.67 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.25 μL，EasyTaqDNA 聚合酶(5 U/μL)0.125 μL，正反引物(50 ng/μL)各0.365 μL，模板DNA(20 ng/μL)1 μL，加ddH2O至10 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增在System-9700型擴增儀上進行。

1.3.4帶型數據統計分析

表1　SSR引物序列

1.3.5指紋圖譜的構建

參考蔣林峰等[14]的方法，根據各品種的特征帶賦值制作該品種的指紋編碼，并根據編碼生成供試煙草品種的DNA指紋圖譜。

2結果與分析

2.1表型性狀特征鑒定

T24和凹葉煙是分別從貴州省石阡縣白龍鄉大槽村、聚鳳鄉廖家坉村煙農種植的云煙87煙田中選出的優良變異單株，2011—2013年經貴州省煙草公司銅仁市公司分別于春秋季在貴州銅仁種植選擇和海南陵水加代培育而成的烤煙新品系。云煙87和K326都是生產上大面積種植的主栽品種，以它們作為對照品種，對T24和凹葉煙的植物學特征、農藝性狀和品質性狀進行了鑒定。

2.1.1植物學性狀特征

從植物學性狀表現(表2)可以看出：T24和凹葉煙與對照品種云煙87和K326在株型、葉形、葉耳、葉面、葉尖、葉緣等植物學性狀方面基本一樣，株型為筒形，葉形為長橢圓，葉耳大小為中等，葉面表面較皺，葉尖漸尖，葉片邊緣為波浪狀；但T24和凹葉煙的長勢比云煙87和K326強，在葉片數、株高、莖圍等性狀上表現出差異。T24的有效葉片數為23.6，莖圍為10.63 cm，節距為5.14 cm，在所有參試品種中排第一，與其他品種的差異都達到了顯著水平；凹葉煙的打頂株高為110.7 cm，是所有參試品種中最高的，與其他品種的差異達到顯著水平。T24和凹葉煙的葉片長寬都大于云煙87和K326。T24和凹葉煙的大田生育期與K326和云煙87相同，均為126 d。

表2　參試品種(系)的主要植物學性狀

表中數據為平均值±標準誤；同列數據后的不同小寫字母表示在P<0.05水平差異有統計學意義。

Data shown are means ± standard errors. The values followed by different lowercase letters in the same column represent statistically significant differences at the 0.05 probability level.

2.1.2經濟性狀表現

從參試品種的經濟性狀指標(表3)可以看出：T24的產量為2 247.38 kg/hm2，產值為53 657.56元/hm2，均價為23.88元/kg，上中等煙率為90.59%，在參試品種中均排名第一，超過對照品種云煙87和K326；凹葉煙的產量為2 195.62 kg/hm2，產值為52 586.47元/hm2，各經濟指標也均超過對照品種。對4個參試品種于2011—2013年田間試驗的經濟性狀指標按混合模型進行方差分析，取顯著水平α=0.05。結果表明，單位面積產量、單位面積產值的品種間差異均達到顯著水平，均價、上等煙率、上中等煙率的品種間差異不顯著，各指標的年度間差異均不顯著。從多重比較結果(表3)可以看出：T24的產量和產值與對照云煙87和K326相比增幅均達顯著水平；凹葉煙的產量和產值與對照云煙87相比增幅均達顯著水平，而與對照云煙K326的增幅未達顯著水平。

表3　參試品種(系)的主要經濟性狀

表中數據為平均值±標準誤；同列數據后的不同小寫字母表示在P<0.05水平差異有統計學意義。

Data shown are means ± standard errors. The values followed by different lowercase letters in the same column represent statistically significant differences at the 0.05 probability level.

2.1.3原煙的外觀和物理特性表現

從參試品種原煙的外觀和物理特性指標(表4)可以看出，T24和凹葉煙與對照品種云煙87和K326相比，主要在煙葉身份、色澤、單葉質量、主脈比例等方面有差異。T24的葉片厚度為0.47 μm，比云煙87厚，但差異在統計學上不顯著；凹葉煙的葉片厚度為0.40 μm，比云煙87薄，差異達到顯著水平；T24和凹葉煙都比K326薄，差異達到顯著水平。T24和凹葉煙的油分與云煙87相同，都為“有”，即尚有油分，表觀有油潤感，好于K326的“稍有”，即較少油分，表觀尚有油潤感。 T24和凹葉煙的煙葉顏色均為橘黃色，與K326相同，而云煙87為檸檬黃色。T24和凹葉煙的光澤均為“強”，而云煙87為“較強”。T24和凹葉煙的單葉質量都低于云煙87和K326，含梗率(主脈比例)都高于云煙87而低于K326。

表4　參試品種(系)原煙的外觀和物理特性

表中數據為平均值±標準誤；同列數據后的不同小寫字母表示在P<0.05水平差異有統計學意義。

Data shown are means ± standard errors. The values followed by different lowercase letters in the same column represent statistically significant differences at the 0.05 probability level.

2.1.4原煙的化學品質表現

從參試品種原煙的常規化學成分指標(表5)可以看出：T24和凹葉煙的還原糖、總糖、淀粉、總植物堿、氯含量均處于優質煙葉的標準范圍內[14]；在表征化學成分協調性的糖堿比、氮堿比、鉀氯比中T24和凹葉煙均優于對照品種云煙87，與K326接近。

表5　參試品種(系)原煙的化學成分

表中數據為平均值±標準誤；同列數據后的不同小寫字母表示在P<0.05水平差異有統計學意義。

Data shown are means ± standard errors. The values followed by different lowercase letters in the same column represent statistically significant differences at the 0.05 probability level.

2.1.5原煙的感官評吸結果

從參試品種感官評吸結果(表6)可以看出：T24和凹葉煙的香型與云煙87相同，都為中間香型，而K326為中偏清；T24的香氣質、香氣量、余味評吸得分都高于對照品種云煙87和K326，雜氣、刺激性評價得分高于云煙87而低于K326，燃燒性、灰色評價得分與云煙87相同而高于K326，評吸評價總分為80.0分，高于云煙87(76.3分)和K326(77.7分)，在參試品種中居于第一位；凹葉煙的余味、雜氣、刺激性評價得分高于云煙87，香氣質、香氣量、燃燒性、灰色評價得分低于云煙87，評吸評價總分為75.3分，低于云煙87和K326。

表6　參試品種(系)原煙的感官評吸結果

打分標準：香氣質15分，香氣量20分，余味25分，雜氣18分，刺激性12分，燃燒性5分，灰色5分，評吸總分100分。

Grading standards were as follows: aroma quality of 15 scores, aroma quantity of 20 scores, after taste of 25 scores, offensive odor of 18 scores, irritancy of 12 scores, combustibility of 5 scores, ash color of 5 scores, total scores of 100.

2.2DNA指紋圖譜鑒定

2.2.1引物多態性分析

應用SSR分子標記，構建突變系T24和凹葉煙及其親本品種云煙87、突變系片片黃及其親本品種K326、突變系M97-1及其親本品種云煙97以及烤煙新品系09-1和客田煙的DNA指紋圖譜。從14條SSR引物(表1)中進一步篩選出4條多態性好、穩定性強、重復性較高的引物PT20213、PT30028、PT30224、PT30399，在9個供試材料中共擴增出18條穩定的多態性條帶，片段大小介于100～400 bp之間(圖1)。這4條引物檢測到的位點多態性信息含量(PIC)值分別為0.71、0.83、0.61和0.67，平均值為0.70。BOTSTEIN等[15]提出，當PIC>0.5為高度多態性，0.25

M:DNA標志物；1：M97-1；2：云煙97；3：K326；4：云煙87；5：T24；6：片片黃；7：凹葉煙；8：客田煙；9：09-1。M: DNA marker; 1: M97-1; 2: Yunyan97; 3: K326; 4: Yunyan87; 5: T24; 6: Pianpianhuang; 7: Aoyeyan; 8: Ketianyan; 9: 09-1.圖1　4對SSR引物擴增結果Fig.1　SSR amplified results of four specific primer pairs

2.2.2DNA指紋圖譜的構建

根據PT20213、PT30028、PT30224、PT30399這4對多態性引物分別擴增出的多態性條帶及其分子質量的大小，從小到大依次賦值為有序整數，從1開始。4個引物共篩選出18個擴增多態性條帶用于賦值。引物的擴增譜帶選擇和賦值結果見表7。

表7參試品種(系)特征譜帶選擇和條帶賦值標準

Table 7Specific band selection and encoded standard for tested varieties and strains

bp

—：沒有條帶。 “—” represents no band.

根據18個多態性條帶在品種間的差異，確定用7個譜帶來構建9個煙草品種的指紋數據庫，即每個品種的DNA指紋數據確定為7位數字，代表4個引物上的7個不同的譜帶。其引物排列順序依次為PT20213、PT30028、PT30224、PT30399，它們提供的特征譜帶數目分別為2、2、1、2。指紋數據庫編碼信息中的數字1～6與擴增條帶分子質量和引物的對應關系見表7。9個煙草品種的指紋數據庫編碼結果(表8)顯示，在構建的煙草品種(品系)DNA指紋數據庫中，每份煙草品種(品系)均具有特異的指紋編碼。

表8　9個煙草品種(系)的指紋數據庫編碼

根據構建的煙草品種DNA 指紋數據庫，繪制9個煙草品種的DNA 指紋圖譜(圖2)，灰色處代表有擴增條帶出現。指紋圖譜與指紋編碼相對應，代表了9個煙草品種的身份信息。從圖2中可以看出，每個品種均具有不同的指紋圖譜，可與其他品種相區分。

bpK326云煙87Yunyan87T24片片黃Pianpianhuang凹葉煙Aoyeyan09-1客田煙KetianyanM97-1云煙97Yunyan97引物Primer100PT30224105PT30224112PT20213121PT20213133PT20213150PT20213152PT30224156PT30224161PT30028167PT30028172PT30028200PT30028211PT30028223PT30028225PT30399251PT30399292PT30399400PT30399

圖29個煙草品種(系)的DNA指紋圖譜

Fig.2DNA fingerprint map of nine tested varieties and strains

2.2.3品種鑒別流程

云煙87及其突變系T24和凹葉煙、K326及其突變系片片黃、云煙97及其突變系M97-1以及烤煙新品系09-1和客田煙共9個烤煙品種(系)，用至少3對引物PT20213、PT30028、PT30399就可將它們完全鑒別開，其鑒別流程見圖3。

同一方框內只有1個品種表示該品種已經與其他方框內的品種區分開；同一方框內有多個品種表示它們之間還沒有彼此區分開。Only one variety in a box means that this variety has been separated from other varieties in other boxes. Several varieties locating in one box means that these varieties in same box have not been separated each other. 圖3　9個煙草品種(系)的鑒別流程Fig.3　Identification process of nine tested varieties and strains

3討論與結論

烤煙的生產利用過程復雜，既涉及田間種植和煙葉烘烤，還涉及卷煙加工利用，因此對烤煙品種的評價，既要進行農業評價，還要進行工業評價，選育出的品種必須使煙農、煙草商業公司和煙草工業公司3方都滿意，從而導致烤煙品種選育難度較大。對現有推廣品種中出現的自然變異進行單株選擇和系統選育，可以在保持現有品種優良性狀的基礎上，進一步克服現有品種的缺點，是培育烤煙新品種的重要途徑.目前已有很多成功的案例，如紅花大金元、中煙103[16]、中煙104[17]、遵煙6號[18]、韭菜坪2號[19]、南江3號[20]、興煙1號[21]、粵煙96[22]、豫煙8號[23]等諸多煙草品種都是采用系統育種途徑育成的。本研究為進一步提高目前烤煙生產上種植面積最大的品種云煙87的抗病性、產量和品質，從貴州省銅仁市煙農種植的云煙87煙田中選擇變異單株，以云煙87和另一個大面積生產種植品種K326作為對照，經純系選擇、品比試驗、區域試驗、生產試驗，對突變體株系的產量和品質等性狀進行鑒定，選育出了烘烤性能、煙葉產量和質量優于云煙87和K326的烤煙新品系T24和凹葉煙。

在煙葉生產和卷煙配料過程中對煙草品種進行鑒別，可以保證卷煙原料品種的準確性[9]。依據田間農藝性狀、初烤煙葉外觀等進行鑒別較難而且不準確，特別是對外觀性狀差異較小的品種，因此，利用分子標記技術建立準確、簡單、快速和高效的DNA指紋圖譜品種鑒別方法對促進煙葉和卷煙生產具有重要意義。構建植物品種指紋圖譜的主要方法有單引物法[24-25]、特征譜帶法[26]和引物組合法[5,27]。引物組合法可以大幅度提高對品種的鑒別能力，極有可能通過幾個多態性高的引物組合就能完成大量品種的鑒定[28-29]。以微衛星序列為基礎的SSR標記在DNA指紋鑒定上顯示出了獨特的優越性：SSR標記數量豐富;覆蓋整個基因組;揭示的多態性高;以孟德爾方式遺傳且呈共顯性。國際植物新品種保護聯盟(International Union for the Protection of New Varieties of Plants，UPOV)在分子測試指南中，將構建DNA指紋數據庫的標記方法確定為SSR和SNP(single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態性)，其中SSR標記因其技術比較成熟，成為當前各個作物建庫的首選標記[30-31]。本研究利用SSR分子標記組合法，對目前生產主栽品種云煙87、云煙97、K326以及從它們中選育出的突變體新品系共9個煙草品種(系)制作了DNA指紋圖譜，并建立了其鑒別流程，可為品種鑒別和保護提供科學依據；但在實際應用中，常常涉及到大規模的品種鑒定，對引物的多態性以及引物組合的要求也相應提高，因此，進一步開發、篩選具有更多特征譜帶、更高效的多態性引物對于鑒別煙草品種(系)非常重要。

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中圖分類號S 572

文獻標志碼A

收稿日期(Received)：2015-05-04；接受日期(Accepted)：2015-08-03；網絡出版日期(Published online)：2016-03-20

*通信作者(

Corresponding author)：張建奎(http://orcid.org/0000-0002-6309-488X)，Tel:+86-23-68250412，E-mail:jkzhang@swu.edu.cn

基金項目：高等學校學科創新引智計劃(B12006)；重慶市煙草專賣局科技項目(渝煙科[2014]80號)。

第一作者聯系方式：陳婷婷(http://orcid.org/0000-0003-3764-1074)，E-mail:84382518@qq.com

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1247.S.20160321.1425.020.html