兒童注意缺陷多動障礙與5-羥色胺R2A基因多態性的相關性研究

梁友芳，農清清，覃健敏，韋宏曠，郭堯平，范 譽，班彩霞，李慕軍

530021廣西南寧市，廣西醫科大學第一附屬醫院(梁友芳，李慕軍)；廣西醫科大學公共衛生學院(農清清，郭堯平，范譽)；南寧市疾病預防控制中心(覃健敏)；廣西壯族自治區疾病預防控制中心(韋宏曠)；廣西壯族自治區婦幼保健院(班彩霞)

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·論著·

兒童注意缺陷多動障礙與5-羥色胺R2A基因多態性的相關性研究

梁友芳，農清清，覃健敏，韋宏曠，郭堯平，范 譽，班彩霞，李慕軍

530021廣西南寧市，廣西醫科大學第一附屬醫院(梁友芳，李慕軍)；廣西醫科大學公共衛生學院(農清清，郭堯平，范譽)；南寧市疾病預防控制中心(覃健敏)；廣西壯族自治區疾病預防控制中心(韋宏曠)；廣西壯族自治區婦幼保健院(班彩霞)

【摘要】目的探討5-羥色胺(5-HT)R2A基因單核苷酸多態性與兒童注意缺陷多動障礙(ADHD)的關系。方法于2011年12月—2013年1月廣西兒童ADHD流行病學抽樣調查篩查出的ADHD患兒中，采用隨機數字表法選取158例為病例組，另在與ADHD患兒同一聚居區非ADHD者中選擇性別、年齡匹配的159例為對照組。取外周靜脈血5 ml，提取DNA。根據HapMap提供的存在于中國人群5-HT R2A基因的單核苷酸多態位點(SNPs)數據，及國內外相關文獻，選擇14個SNPs進行研究，并設計引物序列。PCR擴增，于反應終點判讀基因型。結果病例組與對照組rs2770304、rs985934和rs6311位點的基因型分布不同，病例組CC/CT基因型頻率高于對照組，TT基因型頻率低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。病例組rs2770304、rs985934、rs4941573、rs2070040、rs6313和rs6311位點關聯等位基因頻率高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。rs1745837、rs3742279和rs2296972位點兩兩間存在強連鎖不平衡(D′和r2均大于0.95)，rs2770304、rs985934和rs4941573位點兩兩間存在較強連鎖不平衡，rs2070040與rs6313、rs6311位點存在較強連鎖不平衡。病例組單體型CCA、ACC頻率高于對照組，單體型TTG、GTT頻率低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論5-HT R2A基因rs2770304、rs985934、rs4941573、rs2070040、rs6313和rs6311位點多態性及單體型CCA、ACC、TTG、GTT可能與兒童ADHD的發生有關。

【關鍵詞】注意力缺陷障礙伴多動；5-羥色胺；多態性,單核苷酸；連鎖不平衡

梁友芳，農清清，覃健敏，等.兒童注意缺陷多動障礙與5-羥色胺R2A基因多態性的相關性研究[J].中國全科醫學，2016，19(11)：1287-1291.[www.chinagp.net]

Liang YF,Nong QQ,Qin JM，et al.Association of 5-HT R2A gene polymorphism and attention deficit hyperactivity disorder in children[J].Chinese General Practice，2016，19(11)：1287-1291.

注意缺陷多動障礙(ADHD)是一種多見于學齡期兒童的精神障礙，主要表現為與其同齡兒童相比活動過度、注意力不集中，可伴有學習成績低下和沖動行為[1]。目前ADHD的病因及發病機制尚不十分明確，但家系研究、雙生子和寄養子研究結果顯示，遺傳因素是ADHD的重要發病因素，平均遺傳度約為76%[2]。5-羥色胺(5-HT)系統相關受體均定位于與學習和記憶有關的腦區，如前額葉皮質、海馬和杏仁核等[3]，20世紀70年代已有關于5-HT系統與ADHD關系的研究[4]，5-HT受體和5-HT轉運體目前研究較多。有研究認為，5-HT系統相關基因的變異可能是ADHD的病因之一[5]。本研究選擇5-HT R2A基因14個單核苷酸多態位點(SNPs)進行研究，探討其基因多態性與ADHD之間的關聯。

1對象與方法

1.1研究對象于2011年12月—2013年1月廣西兒童ADHD流行病學抽樣調查篩查出的ADHD患兒中，采用隨機數字表法選取158例為病例組，其中男141例，女17例；年齡6.0～13.5歲，平均年齡7.8歲。病例組納入標準：(1)符合《美國精神障礙診斷與統計手冊》第四版(DSM-Ⅳ)[6]中ADHD的診斷標準；(2)3代內屬本民族血緣；(3)取得患者及家屬或法定監護人的同意，并簽署知情同意書。排除患有兒童精神分裂癥、情感障礙、孤獨癥、精神發育遲滯及其他器質性疾病者。在與ADHD患兒同一聚居區非ADHD者中選擇性別、年齡匹配的159例為對照組，其中男139例，女20例；年齡6.0～14.0歲，平均年齡9.0歲。對照組納入標準：(1)3代內屬本民族血緣的健康人；(2)無嚴重軀體疾病、藥物依賴史和其他精神疾病史；(3)自愿參加本研究并知情同意。兩組受試者上代均無族間通婚史，亦無親緣關系。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取取外周靜脈血5 ml，置于EDTA試管抗凝,后保存于-20 ℃冰箱。采用DNA提取試劑盒提取DNA，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2基因位點選擇及基因分型根據HapMap提供的存在于中國人群5-HT R2A基因的SNPs數據，及國內外相關文獻[7-9]，選擇14個SNPs進行研究。采用Assay Designer 3.1軟件進行引物設計，由博淼生物科技(北京)有限公司合成。采用 Sequenom Mass Array系統進行PCR擴增，于反應終點判讀基因型。PCR在384孔板(包含10 ng DNA的5 μl體系)中進行。PCR循環參數：94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共45個循環。

1.3統計學方法采用Haploview軟件進行5-HT R2A基因多態位點Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗和連鎖不平衡分析；采用SPSS 19.0軟件包進行χ2檢驗分析5-HT R2A基因多態性與ADHD的關聯。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗經Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，病例組和對照組各SNPs基因型頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規律(P>0.05，見表1)，表明選擇的樣本具有群體代表性，基因頻率能代表群體的基因分布。

表1　5-HT R2A基因Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

注：SNPs=單核苷酸多態位點

2.2病例組與對照組5-HT R2A基因多態位點基因型和等位基因頻率比較病例組與對照組rs2770304、rs985934和rs6311位點的基因型分布不同，病例組CC/CT基因型頻率高于對照組，TT基因型頻率低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組余位點基因型分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)。病例組rs2770304、rs985934、rs4941573、rs2070040、rs6313和rs6311位點關聯等位基因頻率高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組余位點關聯等位基因頻率比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表2)。

2.35-HT R2A基因14個SNPs位點連鎖不平衡分析當連鎖不平衡系數(D′)和關聯系數(r2)≥0.80時，表示兩位點存在強連鎖不平衡[10]。應用Haploview軟件對14個SNPs位點兩兩間的連鎖不平衡分析表明，rs1745837、rs3742279和rs2296972位點兩兩間存在強連鎖不平衡(D′和r2均大于0.95)，rs2770304、rs985934和rs4941573位點兩兩間存在較強連鎖不平衡，rs2070040與rs6313、rs6311位點存在較強連鎖不平衡，rs6313和rs6311位點存在強連鎖不平衡(D′=1，r2=0.98)。14個SNPs位點可構成3個單體型塊，其中Block2和Block3兩個單體塊間存在強連鎖不平衡，連鎖不平衡系數為0.98(見圖1)。

表2病例組和對照組5-HT R2A基因多態位點關聯等位基因頻率比較

Table 2Comparison of the frequency of alleles associated with SNPs in 5-HT R2A gene between case group and control group

SNPs關聯等位基因關聯等位基因頻率病例組(n=158) 對照組(n=159)χ2值P值OR(95%CI)rs3125C0.1280.1031.0050.3161.29(0.79,2.11)rs7997012-0.6990.69901.0001.00(0.71,1.41)rs1923884C0.5630.5540.0490.8241.04(0.76,1.42)rs1745837C0.5700.5540.1530.6951.07(0.78,1.46)rs3742279G0.5630.5510.0970.7551.05(0.77,1.44)rs2296972T0.5730.5540.2140.6441.08(0.79,1.48)rs2224721A0.2660.2201.8190.1781.29(0.89,1.85)rs1928040C0.1940.1700.5860.4441.17(0.78,1.76)rs2770304C0.2180.1377.1410.0081.76(1.16,2.67)rs985934C0.2370.1566.5840.0101.68(1.13,2.51)rs4941573A0.3060.2284.8890.0271.50(1.05,2.14)rs2070040A0.2630.1914.5990.0321.51(1.04,2.20)rs6313C0.3150.2394.5790.0321.47(1.03,2.09)rs6311C0.3150.2315.6300.0181.54(1.08,2.19)

2.45-HT R2A基因多態位點構建的單體型分析14個SNPs共發現7個主要單體型(頻率>5%)，病例組單體型CCA、ACC頻率高于對照組，單體型TTG、GTT頻率低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；兩組余單體型頻率比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表3)。

注：方塊中的數字表示連鎖不平衡系數D′

圖15-HT R2A基因多態位點連鎖不平衡分析

Figure 1Linkage disequilibrium analysis of SNPs in 5-HT R2A gene

表3病例組與對照組5-HT R2A基因多態位點構建的單體型頻率比較

Table 3Comparison of the haplotype frequency of 5-HT R2A SNPs between case group and control group

單體型單體型頻率病例組(n=158) 對照組(n=159)χ2值P值OR(95%CI)單體型塊1 CGT0.5630.5450.2230.6371.08(0.79,1.47) TAG0.4240.4360.0960.7560.95(0.69,1.30)單體型塊2 TTG0.6940.7735.0250.0250.66(0.46,0.95) CCA0.2170.1376.8400.0091.74(1.15,2.65) TTA0.0670.0710.0340.8530.95(0.51,1.77)單體型塊3 GTT0.6830.7614.7520.0290.68(0.48,0.96) ACC0.2630.1914.5990.0321.51(1.04,2.20)

3討論

研究表明，5-HT系統功能降低與攻擊、沖動、ADHD等破壞性行為的發生有關[11]，目前關于5-HT在ADHD中的分子遺傳學研究主要集中在5-HT受體和5-HT轉運體。5-HT R2A是人體中重要的中樞神經遞質，與人類行為、情緒調控等多種精神活動密切相關。5-HT R2A是一種抑制性受體，其T102C由T到C突變，可使5-HT2A的表達降低，從而使5-HT R2A結合力下降，神經元的興奮性提高[12]。研究發現，5-HT R2A的T102C突變與ADHD發生有關[13]。5-HT R2A基因可影響認知功能，其啟動子區-1438A/G多態性能夠調節5-HT R2A啟動子的活性，進而影響5-HT R2A基因的表達水平[14]。-1438A/G多態性與重型抑郁癥、沖動行為相關[15-16]。錢秋謹等[17]報道5-HT R2A基因-1438A/G多態性是中國漢族ADHD患兒智商的影響因素。

人類5-HT R2A定位于第13號染色體長臂14～21區(13q14～21)，是由1 413個核苷酸開放閱讀框架編碼的471個氨基酸組成，基因跨度范圍為20 kb，擁有3個外顯子和2個內含子。目前共發現5-HT R2A基因存在6種多態性，包括2種靜息多態性T102C和C516T，3種結構多態性Thr25Asn、His452Thr和Ala447Val，此外，5-HT R2A基因啟動子區1 438位有A或G堿基變化，形成A1438G多態性[18]。本研究選擇了14個SNPs位點，其中包括rs6313(T102C)和rs6311(G1438A)。本研究發現，與對照組比較，病例組rs6311(T102C)位點CC/CT基因型頻率較高，TT基因型頻率較低，提示CC/CT可能是ADHD發病的危險因素，TT可能是ADHD的保護因素，與侯雪等[13]報道的一致。病例組rs2770304、rs985934、rs4941573、rs2070040、rs6313和rs6311位點的關聯等位基因頻率均較高，提示上述位點可能與ADHD有關。

rs6313(T102C)多態性是位于外顯子上的靜息多態性，該位點的突變并不改變氨基酸序列，但可能影響mRNA的次級結構，且與其他多態性位點存在連鎖不平衡。許多針對不同人群的研究證實，rs6313位點與啟動子區的rs6311(G1438A)存在完全的連鎖不平衡[19]。連鎖不平衡分析是研究位點間關聯性的一種方法，通過連鎖不平衡分析可能有助于發現與研究內容關聯的核苷酸多態性。本研究發現rs6313與rs6311、rs2070040位于同一單體型塊，且與rs6311存在強連鎖不平衡(D′=1，r2=0.98)，與rs2070040存在較強連鎖不平衡。rs1745837、rs3742279和rs2296972位點位于同一單體型塊，且兩兩間也存在很強的連鎖不平衡(D′和r2均大于0.95)，rs2770304、rs985934和rs4941573位點位于同一單體型塊，且兩兩間存在強連鎖不平衡。但Heiser等[20]在102個家系的229例ADHD患者中未發現5-HT R2A rs6313、rs6314、rs6311多態性位點傳遞不平衡。同一單體型塊中的SNPs間連鎖不平衡，提示位點間沒有發生重組，所有的SNPs有共同一并遺傳的趨勢。

單體型是指一條染色體上緊密連鎖的多個等位基因的線性排列。大多數染色體區域只有少數幾個常見的單體型(每個具有至少5%的頻率)，代表了一個群體中的大部分多態性，多態性位點單體型的構建則是這種遺傳關聯的體現，單體型的研究能夠揭示多個SNPs與疾病等的關聯[10]。本研究在病例組和對照組中發現了7個主要單體型(頻率>5%)，其中病例組單體型CCA、ACC的頻率高于對照組，單體型TTG、GTT的頻率低于對照組，提示單體型CCA、TTG、GTT和ACC可能與ADHD存在一定的關聯性。

綜上所述，本研究結果提示5-HT R2A基因6個SNPs及4個單體型與ADHD的發生可能存在一定相關性。但ADHD是多基因遺傳的復雜疾病，是多個基因交互作用的結果，而每個基因只發揮微效作用[21]，該結論尚需在其他地區、不同人群中進一步驗證。

作者貢獻：梁友芳、農清清、覃健敏進行課題設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；韋宏曠、郭堯平、范譽、班彩霞進行課題實施、評估、資料收集；李慕軍進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：吳立波)

Association of 5-HT R2A Gene Polymorphism and Attention Deficit Hyperactivity Disorder in Children

LIANGYou-fang,NONGQing-qing,QINJian-min，etal.

TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the association between 5-HT R2A gene single nucleotide polymorphisms and attention deficit hyperactivity disorder(ADHD) in children.MethodsBy random number table method,we enrolled 158 ADHD children as case group,from ADHD children found in the ADHD epidemiological sampling survey among children in Guangxi Province conducted from December 2011 to January 2013.We also enrolled 159 children without ADHD with matching genders and ages among normal population in the same residential areas of children with ADHD as control group.From each subject,5 ml peripheral venous blood was sampled,and DNA was extracted.According to the data about SNPs in the 5-HT R2A gene of Chinese provided by HapMap and relevant literature published at home and abroad,we selected 14 SNPs and designed primer sequence.After PCR amplification,genotypes were determined at the reaction endpoint.ResultsCase group and control group were significantly different in the genotype distribution of rs2770304,rs985934 and rs6311 locus;case group was higher in the frequency of CC/CT genotype and lower in the frequency of TT genotype than control group(P<0.05).Case group was higher than control group in the frequency of alleles associated with rs2770304,rs985934,rs4941573,rs2070040,rs6313 and rs6311 locus(P<0.05).Strong linkage disequilibrium existed among rs1745837,rs3742279 and rs2296972 locus (D′ and r2 were both larger than 0.95),among rs2770304,rs985934 and rs4941573 locus,among rs2070040,rs6313 and rs6311 locus.Case group was higher in the haplotype frequency of CCA and ACC and lower in the frequency of haplotype TTG and GTT than control group (P<0.05).ConclusionThe polymorphism of rs2770304,rs985934,rs4941573,rs2070040,rs6313 and rs6311 locus and haplotype CCA,ACC,TTG and GTT of 5-HT R2A gene may be correlated with ADHD in children.

【Key words】Attention deficit disorder with hyperactivity；5-Hydroxytryptamine；Polymorphism,single nucleotide；Linkage disequilibrium

(收稿日期：2015-10-15；修回日期：2016-03-04)

【中圖分類號】R 742.89

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.11.012

通信作者：農清清，530021廣西南寧市，廣西醫科大學公共衛生學院；E-mail：nnqq26@163.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81360420)；廣西自然科學基金面上項目(2011GXNSFA018294)；廣西高等學校重點資助科研項目(201202ZD020)