可溶性klotho蛋白與慢性腎臟病患者體內氧化應激的關系研究

林書典，詹 鋒，武 偉，潘楚瑛，張 延，劉 穎，楊 舟，黃艷艷，黃 瑋，王 茹，詹宇威

570311海南省海口市，海南省人民醫院腎病風濕科

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·論著·

可溶性klotho蛋白與慢性腎臟病患者體內氧化應激的關系研究

林書典，詹 鋒，武 偉，潘楚瑛，張 延，劉 穎，楊 舟，黃艷艷，黃 瑋，王 茹，詹宇威

570311海南省海口市，海南省人民醫院腎病風濕科

【摘要】目的探討慢性腎臟病(CKD)患者體內氧化應激狀態，初步明確可溶性klotho蛋白(s-kl)在CKD患者體內氧化應激中的作用和意義。方法選取2012年1月—2014年12月在海南省人民醫院腎病風濕科門診或住院診治的CKD患者共89例，均符合美國國家腎臟病基金會制定的腎臟病預后質量倡議(K/DOQI-CKD)診斷標準。根據CKD分期將入選患者分為CKD1～2組(27例)、CKD3～4組(35例)和CKD5組(27例)。清晨空腹采集患者靜脈血，常規方法檢測血常規和血生化指標。采用ELISA法檢測s-kl，硫代巴比妥酸法檢測丙二醛(MDA)，羥胺法檢測總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性，比色法檢測總抗氧化力(T-AOC)，分光光度法檢測還原型谷胱甘肽(GSH)。用核素腎動態顯像((99)Tcm-DTPA)檢測腎小球濾過率(GFR)。比較組間差異，部分指標間的依存關系采用Pearson相關分析和直線回歸分析。結果3組CKD患者s-kl、MDA、T-SOD、T-AOC及GSH水平比較，差異均有統計學意義(P<0.001)。其中，CKD3～4組和CKD5組s-kl、T-SOD、T-AOC和GSH水平較CKD1～2組下降，而MDA水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；CKD5組s-kl、T-SOD、T-AOC和GSH水平較CKD3～4組降低，MDA水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。相關分析顯示，s-kl與T-SOD、T-AOC及GSH呈正相關關系(r=0.428、0.502、0.531，P<0.05)，與MDA呈負相關關系(r=-0.434，P<0.05)。線性回歸分析顯示，s-kl與MDA、T-SOD、T-AOC間存在線性依存關系(P<0.05)，而s-kl與GSH無線性回歸關系(P>0.05)。結論CKD患者體內存在氧化應激，s-kl降低與腎臟氧化損傷密切相關。

【關鍵詞】腎疾病；氧化性應激；Klotho蛋白

林書典，詹鋒，武偉，等.可溶性klotho蛋白與慢性腎臟病患者體內氧化應激的關系研究[J].中國全科醫學，2016，19(11)：1297-1300.[www.chinagp.net]

Lin SD,Zhan F,Wu W,et al.Correlation between soluble klotho protein and oxidative stress in patients with chronic kidney diseases[J].Chinese General Practice，2016，19(11)：1297-1300.

氧化應激是慢性腎臟病(CKD)進展及惡化的重要影響因素之一[1]，抗氧化應激治療日益成為臨床關注的熱點[2]。klotho蛋白是一種與腎臟疾病密切相關的調控因子，主要表達于大腦脈絡膜和腎小管組織中，其表達上調可延緩CKD和腎臟纖維化的進展[3-4]。研究發現，klotho蛋白可作為一種抗氧化調節因子參與CKD的抗氧化應激損傷[5]，因此，本研究擬在CKD患者中檢測可溶性klotho蛋白(s-kl)水平，探討其與CKD患者體內氧化應激的關系。

1資料與方法

1.1臨床資料選取2012年1月—2014年12月海南省人民醫院腎病風濕科門診或住院的CKD患者共89例，均符合美國國家腎臟病基金會制定的腎臟病預后質量倡議(Kidney Disease Outcome Quality Initiative，K/DOQI-CKD)診斷標準[6]。根據CKD分期將入選患者分為CKD1～2組(27例)、CKD3～4組(35例)和CKD5組(27例)。病例納入標準：年齡≥18歲，入選前2周內未服用具有抗氧化作用的藥物、心肺功能穩定及肝功能基本正常者。病例排除標準：有透析(腹膜透析或血液透析)史、有腫瘤及自身免疫性疾病史、1個月內患有感染性疾病、輸血、創傷和手術史、半年內服用中等量以上激素(相當于潑尼松 0.5 mg·kg-1·d-1以上)超過30 d、C反應蛋白水平升高者。本研究獲得海南省人民醫院醫學倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2常規血清學指標檢測患者清晨空腹采集靜脈血(2×10 ml)，提取血清置-80 ℃低溫冰箱中保存備檢測。采用全自動血液細胞學分析儀檢測血常規，全自動生化分析儀檢測血生化指標等。采用核素腎動態顯像(99Tcm-DTPA)檢測腎小球濾過率(GFR)。

1.3s-kl、丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、總抗氧化力(T-AOC)和還原型谷胱甘肽(GSH)檢測采用ELISA法檢測s-kl(Immune-Biological Laboratories Co.Ltd,Gunma,Japan)。采用硫代巴比妥酸(TBA)法檢測MDA，羥胺法檢測T-SOD活性，比色法檢測T-AOC，分光光度法檢測GSH；試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，按照產品試劑盒說明書操作。

2結果

2.1臨床資料比較3組患者原發疾病構成比比較，差異無統計學意義(χ2=1.088，P=0.581，見表1)。

3組CKD患者的平均動脈壓(MAP)、血紅蛋白(Hb)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、血鈣(Ca2+)、血磷(P)、堿性磷酸酶(ALP)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)水平、GFR比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；余指標間比較，差異無統計學意義(P>0.05,見表2)。

表13組CKD患者原發疾病構成比比較〔n(%)〕

Table1Comparisonofprimarydiseaseconstitutionamongthethreegroups

組別例數CGNDNHNTINON其他CKD1～2組2711(40.8)3(11.1)4(14.8)2(7.4)5(18.5)2(7.4)CKD3～4組3514(40.0)7(20.0)6(17.1)5(14.3)2(5.7)1(2.9)CKD5組279(33.3)4(14.8)5(18.6)3(11.1)3(11.1)3(11.1)

注：CKD=慢性腎臟病，CGN=慢性腎小球腎炎，DN=糖尿病腎病，HN=高血壓腎小動脈硬化癥，TIN=腎小管間質性腎病，ON=梗阻性腎病

2.23組s-kl、MDA、T-SOD、T-AOC和GSH水平比較3組CKD患者s-kl、MDA、T-SOD、T-AOC及GSH水平比較，差異均有統計學意義(P<0.001)。其中，CKD3～4組和CKD5組s-kl、T-SOD、T-AOC和GSH水平較CKD1～2組降低，而MDA水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；CKD5組中s-kl、T-SOD、T-AOC和GSH水平較CKD3～4組降低，MDA水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05，見表3)。

2.3s-kl與MDA、T-SOD、T-AOC及GSH相關性分析相關性分析顯示，s-kl與MDA呈負相關,與T-SOD、T-AOC及GSH呈正相關(P<0.05，見表4)。

表2　3組CKD患者基本臨床資料比較

注：與CKD1～2組比較，aP<0.05；與CKD3～4組比較，bP<0.05；c為χ2值；MAP=平均動脈壓，Hb=血紅蛋白，ALT=丙氨酸氨基轉移酶，AST=天冬氨酸氨基轉移酶，Alb=清蛋白，Ca2+=血鈣，P=血磷，ALP=堿性磷酸酶，TC=總膽固醇，TG=三酰甘油，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，BUN=尿素氮，Scr=血肌酐，GFR=腎小球濾過率

2.4s-kl與MDA、T-SOD、T-AOC及GSH線性回歸分析以s-kl為自變量，以MDA、T-SOD、T-AOC和GSH為因變量，分別進行線性回歸分析，結果顯示s-kl與MDA、T-SOD、T-AOC間存在線性依存關系(P<0.05)，而s-kl與GSH無線性回歸關系(P>0.05,見表5)。

Table 3Comparison of the levels of s-kl,MDA,T-SOD,T-AOC and GSH among the three groups

組別例數s-kl(ng/L)MDA(nmol/ml)T-SOD(U/ml)T-AOC(U/ml)GSH(mg/L)CKD1～2組27717.7±144.93.66±0.9891.2±20.912.7±3.238.9±8.5CKD3～4組35521.7±135.7a7.02±2.01a76.6±16.2a8.2±1.2a29.1±7.2aCKD5組27401.7±90.5ab7.33±2.07ab66.0±15.2ab7.0±2.0ab25.2±5.9abF值43.02035.64014.19050.02025.630P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

注：與CKD1～2組比較，aP<0.05；與CKD3～4組比較,bP<0.05；s-kl=可溶性klotho蛋白，MDA=丙二醛，T-SOD=總超氧化物歧化酶，T-AOC=總抗氧化力，GSH=還原型谷胱甘肽

表4　s-kl與MDA、T-SOD、T-AOC及GSH的相關性分析

表5s-kl與MDA、T-SOD、T-AOC和GSH關系的線性回歸分析

Table 5Linear regression analysis on correlation between s-kl and MDA,T-SOD,T-AOC and GSH

因變量bSEt值P值MDA-0.0230.0043.0440.012T-SOD0.6140.1123.2450.001T-AOC0.2590.0982.4900.016GSH0.2080.1320.8370.254

3討論

氧化應激是由于機體內氧化物質增多，抗氧化防御能力下降或缺陷引起氧化/抗氧化失衡，導致細胞組織損傷的過程，其作為腎損害的非傳統因素日益受到關注并逐漸成為研究的熱點。氧化應激貫穿CKD的發生發展全過程，是多種病理損傷的共同途徑。氧化物質可直接攻擊腎組織細胞膜蛋白、脂質及核酸，抑制線粒體內呼吸鏈生物酶活性，影響細胞的正常功能。研究發現，CKD發展惡化與體內氧化物質活性氧(ROS)的增多，抗氧化物質的減少密切相關[7]。

3.1CKD患者體內氧化應激Vostalova等[8]在腎移植患者中發現，晚期氧化蛋白產物(AOPP)較腎移植前下降，而GSH水平升高，提示終末期腎病(ESRD)患者體內氧化/抗氧化失衡，存在氧化應激。在本研究中同樣發現，隨著GFR的下降，氧化物質MDA逐漸升高，而抗氧化物質T-SOD和GSH逐漸降低，氧化/抗氧化失衡與腎功能惡化呈并行趨勢，表明氧化應激是CKD持續進展的可能性因素[9-10]。與其他研究[11]不同的是，在本研究中，T-AOC隨著腎功能的惡化而下降，是否與整體抗氧化物質減少所致仍不明確，但T-AOC被認為是CKD患者氧化應激的關鍵標志物[12]，其在CKD患者體內的變化仍有爭議。有學者認為，T-AOC的升高可能與CKD患者高尿酸以及體外以過氧化氫(H2O2)為底物的T-AOC檢測有關[13]，而確切機制仍有待研究闡明。

3.2klotho蛋白及其抗氧化機制klotho蛋白是一種影響CKD發生發展的重要跨膜蛋白，腎臟是其表達的主要器官。klotho蛋白以兩種形式存在，即膜結合性klotho(m-kl)和s-kl，s-kl以酶切裂解的方式從細胞膜表面與m-kl分離，直接釋放至血液循環中。通過檢測血液中s-kl水平，可反映出klotho蛋白的表達水平。目前已證實，klotho蛋白隨著GFR的下降而表達減少，腎臟纖維化逐漸加重[14]，在本研究中也再次證明了這一點。研究發現，Kl-/-小鼠出現嚴重的氧化應激損傷，而在H2O2干預下，轉染klotho基因的IMCD3細胞凋亡明顯減少，klotho蛋白預處理的HeLa細胞脂質過氧化受到抑制，這些實驗結果均提示klotho具有抗氧化和抗凋亡的功能，其機制可能是激活FOXO轉錄信號途徑和刺激SOD生成增多的結果[15]。Oh等[16]研究表明，ESRD患者循環血中s-kl水平的下降與氧化應激的增強密切相關。同樣，本研究顯示，s-kl與T-SOD、T-AOC及GSH呈正相關，而與MDA呈負相關，并且線性回歸分析結果發現s-kl與MDA、T-SOD和T-AOC存在線性依存關系。有研究發現，klotho蛋白表達上調可抑制腎組織中MDA水平的增高，提高T-SOD、T-AOC及GSH活性水平[15]，其機制可能是通過活性氧敏感性凋亡信號調節激酶信號復合物，調控p38-MAPK以及cAMP-PKA通路從而影響體內氧化應激狀態[17-18]，因此提示klotho蛋白在CKD患者體內水平的變化與氧化/抗氧化失衡有密切聯系，其表達水平的下降可能是腎臟氧化損傷加重的原因之一。

本文創新點：

探討可溶性klotho蛋白在CKD患者體內水平與氧化應激的關系，為今后進一步研究klotho蛋白對CKD進展的影響提供基礎理論支撐。

本文不足：

本研究結果僅初步揭示了可溶性klotho蛋白在CKD患者氧化應激中可能存在的促進作用，但其確切機制仍有待進一步的研究以闡明。

作者貢獻：林書典負責試驗設計、撰寫論文并對論文負責；詹鋒負責試驗質控、指導及論文審校；武偉、潘楚瑛、張延負責收集臨床病例；劉穎、楊舟、黃艷艷、黃瑋負責標本收集、臨床資料收集和匯總；王茹、詹宇威負責臨床標本檢測。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：趙躍翠)

Correlation Between Soluble Klotho Protein and Oxidative Stress in Patients With Chronic Kidney Diseases

LINShu-dian,ZHANFeng,WUWei,etal.

DepartmentofNephrology&Rheumatology,HainanGeneralHospital,Haikou570311,China

【Abstract】ObjectiveTo study the oxidative stress in patients with chronic kidney disease (CKD),and to clarify the role of soluble klotho(s-kl) protein in the oxidative stress of CKD patients.MethodsWe enrolled 89 CKD patients or inpatients from the Department of Nephrology & Rheumatology of Hainan General Hospital from January 2012 to December 2014.All patients were consistent with the K/DOQI-CKD criteria.According to CKD staging,the patients were divided into three groups:CKD1-2 group(n=27),CKD3-4 group(n=35)and CKD5 group(n=27).Morning fasting venous blood was sampled,and routine blood indexes and biochemical indexes were detected using conventional methods.S-kl was measured using ELISA;malondialdehyde (MDA) was detected by thiobarbituric acid method;total superoxide dismutase (T-SOD) activity;total antioxidant capacity (T-AOC) was measured by colorimetry and reduced glutathione (GSH) were determined by hydroxylamine method and spectrophotometry respectively.Glomerular filtration rate(GFR) was detected by radionuclide renal dynamic imaging ((99)Tcm-DTPA).Intergroup differences were analyzed and Pearson correlation analysis and linear regression were applied to reveal the correlation among the parameters.ResultsThe three groups were significantly different in the levels of s-kl,MDA,T-SOD,T-AOC and GSH (P<0.001).CKD3-4 group and CKD5 group were lower in the levels of s-kl,T-SOD,T-AOC and GSH but were higher in the level of MDA than CKD1-2 group (P<0.05).CKD5 group was lower in the levels of s-kl,T-SOD,T-AOC and GSH and higher in the level of MDA than CKD3-4 group (P<0.05).Correlation analysis showed that s-kl had positive correlation with T-SOD,T-AOC and GSH (r=0.428,0.502,0.531；P<0.05),and had negative correlation with MDA (r=-0.434，P<0.05).Linear regression analysis showed that s-kl had linear regression relationship with MDA,T-SOD and T-AOC(P<0.05),but had no linear regression relationship with GSH(P>0.05).ConclusionOxidative stress exists in CKD patients,and the reduction of s-kl protein level is closely correlated with kidney oxidative damage.

【Key words】Kidney diseases；Oxidative stress；Klotho protein

(收稿日期：2015-09-15；修回日期：2015-12-20)

【中圖分類號】R 692

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.11.014

通信作者：詹鋒，570311海南省海口市，海南省人民醫院腎病風濕科；E-mail：renal@126.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81360118)；海南省自然科學基金資助項目(309087)