不同分子類型乳腺癌骨形態發生蛋白6表達的臨床意義

丁 梅，胡 芬，王增輝，楊艷玲，馬振玲，李宗富，李潤華

063000河北省唐山市協和醫院(丁梅，王增輝，楊艷玲，馬振玲，李宗富，李潤華)；華北理工大學生命科學院(胡芬)

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·論著·

不同分子類型乳腺癌骨形態發生蛋白6表達的臨床意義

丁 梅，胡 芬，王增輝，楊艷玲，馬振玲，李宗富，李潤華

063000河北省唐山市協和醫院(丁梅，王增輝，楊艷玲，馬振玲，李宗富，李潤華)；華北理工大學生命科學院(胡芬)

【摘要】目的 探討不同分子類型乳腺癌患者骨形態發生蛋白6(BMP-6)表達情況及其與臨床病理特征的關系。方法選取2013年1月—2015年3月在唐山市協和醫院普外科接受手術并經病理證實的女性乳腺癌患者426例，其中Luminal A型149例，Luminal B型97例，表皮生長因子受體2(Her-2)陽性型72例，Basal-like型108例。采用實時熒光定量反轉錄PCR檢測不同分子類型乳腺癌BMP-6 mRNA表達情況，采用免疫組織化學染色法檢測不同分子類型乳腺癌BMP-6表達情況，并對不同分子類型乳腺癌患者臨床特征進行比較。結果不同分子類型乳腺癌組織BMP-6 mRNA表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中Basal-like型BMP-6 mRNA表達水平低于Luminal A型(P<0.05)。不同分子類型乳腺癌組織BMP-6 mRNA表達水平均低于癌旁組織(P<0.01)。不同分子類型乳腺癌組織BMP-6表達水平比較，差異有統計學意義(χ2=19.01，P=0.02)；其中Luminal A型陰性(-)率低于Basal-like型(χ2=5.17，P=0.002)；Luminal A型強陽性(+++)率高于Basal-like型(χ2=8.84，P<0.001)。不同分子類型乳腺癌患者淋巴結轉移率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；不同分子類型乳腺癌患者腫瘤最大徑分布、內臟轉移率比較，差異均有統計學意義(P<0.01)；其中Basal-like型內臟轉移率高于Luminal A型(χ2=14.71，P<0.001)。結論BMP-6在不同分子類型乳腺癌中的表達具有差異性，臨床或可對不同類型的乳腺癌患者采取不同的BMP-6治療方案。

【關鍵詞】乳腺腫瘤；骨形態發生蛋白質6；分子分類

丁梅，胡芬，王增輝，等.不同分子類型乳腺癌骨形態發生蛋白6表達的臨床意義[J].中國全科醫學，2016，19(11)：1305-1309.[www.chinagp.net]

Ding M，Hu F，Wang ZH，et al.Clinical significance of the expression of bone morphogenetic proteins 6 in different types of breast cancer[J].Chinese General Practice，2016，19(11)：1305-1309.

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，全世界乳腺癌患者約占癌癥患者的10%，且每年新發病例為100萬，我國約占15萬[1]。乳腺癌的發病率呈逐年上升趨勢，有研究顯示，2002年新檢出的乳腺癌例數為1 151 298例，是1975年的2倍[2]。乳腺癌好發骨轉移，Paget通過對753例乳腺癌患者研究發現，骨微環境適合乳腺癌細胞生存、增殖，且乳腺癌細胞分泌的因子也會進一步改造骨微環境，并由此提出“種子-土壤”理論[3]。

骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是轉化生長因子β(TGF-β)超家族成員，BMPs目前已發現有40多種，其中BMP-6是從鼠胎盤cDNA文庫中分離得到[4]。BMP-6是生長、分化多功能調節因子，最初因其能夠誘導骨和軟骨形成而得名，對骨骼再生修復、胚胎發育均有重要作用，在軟骨細胞成熟、角蛋白形成早期、血清素神經元、胎兒平滑肌發育中均有表達[5]。近年研究表明，BMP-6在乳腺癌、唾液腺癌、前列腺癌中均有表達，推測或與腫瘤骨轉移相關[6]。BMP-6在乳腺癌中的具體作用機制尚不清楚，本研究擬對不同分子類型乳腺癌患者的BMP-6表達情況進行觀察，為乳腺癌輔助治療和預后評析提供參考。

1資料與方法

1.1臨床資料選取2013年1月—2015年3月在唐山市協和醫院普外科接受手術并經病理證實的女性乳腺癌患者426例，年齡26～68歲，平均年齡(48.1±9.1)歲；Luminal A型149例，Luminal B型97例，表皮生長因子受體2(Her-2)陽性型72例，Basal-like型108例；初診腫瘤最大徑<2 cm 155例，2～5 cm 162例，>5 cm 109例；內臟轉移80例，非內臟轉移50例；淋巴結轉移140例。

1.2診斷、分型與排除標準

1.2.1乳腺癌診斷根據我國2011年發布的行業標準診斷：乳房腫物質硬、固定、伴有皮膚凹陷或腋窩淋巴結腫大、短期腫物明顯增大等為首發癥狀；或可出現乳頭近期回縮、血性溢液，單側乳頭乳暈皮膚濕疹樣改變且常規治療無改善；經影像或病理檢查明確診斷[7]。

1.2.2乳腺癌分子分型標準根據2011年第12屆St.Gallen國際乳腺癌會議共識的分型標準：Luminal A型為雌激素受體(estrogen receptor，ER)和/或孕激素受體(progestin receptor，PR)陽性、Her-2陰性、細胞核相關抗原(nuclear-associated antigen)Ki-67<14%；Luminal B型為ER和/或PR陽性、Her-2陰性或陽性、Ki-67≥15%；Her-2陽性型為ER和/或PR陰性、Her-2陽性；Basal-like型(三陰性型)為ER、PR、Her-2陰性[2]。

1.2.3轉移分類內臟轉移指發生在肺、肝、腦等臟器的遠處轉移；非內臟轉移指發生在骨、軟組織為主的轉移。

1.2.4排除標準男性乳腺癌、其他惡性腫瘤或相關腫瘤病史；術前進行放、化療，內分泌等全身治療者；病理、病歷、免疫組織化學資料不全者。

1.3檢測方法

1.3.1實時熒光定量反轉錄PCR(RT-qPCR)患者于乳腺癌術中取癌組織和癌旁組織各一份，于術后30 min內投入液氮進行保存。兩部分組織的RT-qPCR操作步驟相同，以癌組織的操作步驟為例，具體如下。取0.1 g人乳腺癌組織置于研缽中(研缽需預冷)，加入液氮研磨至粉末狀，加入Trizol試劑(Inveitrogen公司)1 ml，混勻，轉入Eppendorf管(1.5 ml，無核酸酶)中，放置5 min，室溫離心(12 000×g)5 min，將上清液轉移至新的Eppendorf管(1.5 ml，無核酸酶)中；加入1/5體積氯仿，振蕩混勻15 s，放置15 min，室溫離心(12 000×g，4 ℃)15 min；吸取上層水相，置于另一離心管，加入2/3體積異丙醇混勻，放置5～10 min，室溫離心(12 000×g，4 ℃)10 min；棄上清液，加入1 ml 75%乙醇，振蕩離心管，懸浮沉淀，離心(8 000×g，4 ℃)5 min；棄上清液，室溫沉淀RNA 5～10 min，加去離子水溶解RNA樣品，凍存(-20 ℃)。在0.2 ml Eppendorf管中加入RNA 2 μl、5×RT Buffer 4 μl、dNTP Mix 2 μl、RNase Inhibitor 0.5 μl、Oligo 2 μl、AMV反轉錄酶2 μl、ddH2O 7.5 μl，室溫下放置10 min，42 ℃孵育1 h，75 ℃加熱15 min，-20 ℃凍存。采用Gene Runner軟件設計引物，引物由上海生工公司合成并提供。BMP-6(308 bp)上游引物5′-CAACAGAGTCGTAATCGCTCTACC-3′(+1 323～+1 346)、下游引物5′-TTAGTGGCATCCACAAGCTCT-3′(+1 701～+1 721)；GAPDH基因(982 bp)上游引物5′-TGAAGGTCGGTGTGAACGGAT-3′、下游引物5′-CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC-3′。在0.2 ml反應管中加入cDNA 2 μl、dNTP Mixture 2 μl、F-primer 1 μl、R-primer 1 μl、10×PCR Buffer 2.5 μl、ROX 0.5 μl、EverGreen 0.5 μl、Taq DNA聚合酶0.4 μl、ddH2O 15.1 μl，94 ℃預變性3 min，按以下步驟進行循環，94 ℃變性30 s，64 ℃延伸60 s，40個循環。每個樣本做3次檢驗，取平均值。

1.3.2免疫組織化學染色檢測SP9100免疫組織化學試劑盒、DAB顯色試劑盒、鼠抗人Actin及辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體均采購于北京天根公司，鼠抗人BMP-6單克隆抗體購于Abcam公司。將凍存的標本置于100 ml甲醛溶液(中性)中固定，石蠟包埋，連續切片(厚度2 μm)呈蠟帶，分隔蠟帶并放于45 ℃溫水上，用粘片劑防止蠟片滑脫，調整蠟片位置將其置于載玻片中央，抗原修復，封閉，應用SP法染色，DAB發色，蘇木素復染，脫水，透明，封固，以PBS代替一抗作陰性對照。應用顯微鏡觀察，由兩位經驗豐富的病理科醫師進行觀察，鏡下棕黃色顆粒即為BMP-6表達，以同一顯微鏡倍數(×40)觀察全片，確定腫瘤浸潤邊緣，選擇10個高倍(×400)視野，每個視野計數100個腫瘤細胞，分析不同視野下染色細胞百分數(陽性細胞占計數同類細胞比例)及染色程度。以陽性染色<10%為陰性(-)；陽性染色10%～30%為弱陽性(+)；陽性染色31%～50%為陽性(++)；陽性染色>50%為強陽性(+++)。

1.3.3ER、PR、Her-2、Ki-67判斷采用免疫組織化學方法對乳腺癌腫瘤標本進行石蠟包埋、切片、染色、洗滌，在切片上加入ER、PR、Her-2、Ki-67一抗、二抗，以DAB顯色，選擇10個顯微鏡(×400)視野，每個視野計數100個腫瘤細胞，分析不同視野下染色細胞百分數。ER、PR染色細胞數<10%或細胞核無染色為陰性(-)、染色細胞數>10%為陽性(+)；Ki-67染色細胞數<30%或細胞核無染色為陰性(-)、染色細胞數≥30%為陽性(+)；運用DAKOHercep Test系統判定Her-2陰性表達為(-或+)、陽性為(++或+++)。

2結果

2.1不同分子類型乳腺癌BMP-6mRNA表達水平比較不同分子類型乳腺癌癌旁組織BMP-6mRNA表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；不同分子類型乳腺癌組織BMP-6mRNA表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中Basal-like型BMP-6mRNA低于LuminalA型，差異有統計學意義(P<0.05)。不同分子類型乳腺癌組織BMP-6mRNA表達水平均低于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.01，見表1)。

Table 1Comparison of the mRNA expression of BMP-6 among different molecule types of breast cancer tissues

分子類型例數癌旁組織癌組織t值P值LuminalA型14987.12±23.1636.15±10.1824.59<0.01LuminalB型9785.15±30.1734.07±12.0815.48<0.01Her-2陽性型7283.16±22.7132.88±16.0715.34<0.01Basal-like型10882.11±18.1931.06±12.08a24.30<0.01F值1.053.78P值0.370.01

注：與Luminal A型比較，aP<0.05；Her-2=表皮生長因子受體2

2.2不同分子類型乳腺癌組織BMP-6表達水平比較不同分子類型乳腺癌組織BMP-6表達水平比較，差異有統計學意義(χ2=19.01，P=0.02)。其中Luminal A型陰性(-)率低于Basal-like型，差異有統計學意義(χ2=5.17，P=0.002)；Luminal A強陽性(+++)率高于Basal-like型，差異有統計學意義(χ2=8.84，P<0.001，見表2)。

表2不同分子類型乳腺癌組織BMP-6表達水平比較〔n(%)〕

Table 2Comparison of the protein expression of BMP-6 among different molecule types of breast cancer tissues

分子類型例數陰性(-)弱陽性(+)陽性(++)強陽性(+++)LuminalA型14912(8.1)60(40.3)50(33.6)27(18.0)LuminalB型9710(10.3)47(48.5)26(26.8)14(14.4)Her-2陽性型729(12.5)36(50.0)17(23.6)10(13.9)Basal-like型10822(20.4)50(46.3)30(27.8)6(5.5)

2.3不同分子類型乳腺癌患者臨床特征比較不同分子類型乳腺癌患者淋巴結轉移率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；不同分子類型乳腺癌患者腫瘤最大徑分布、內臟轉移率比較，差異均有統計學意義(P<0.01)；其中Basal-like型內臟轉移率高于Luminal A型，差異有統計學意義(χ2=14.71，P<0.001，見表3)。

3討論

表3不同分子類型乳腺癌患者臨床特征比較〔n(%)〕

Table 3Comparison of clinical features among different molecule types of breast cancer patients

臨床特征例數LuminalA型(n=149)LuminalB型(n=97)Her-2陽性型(n=72)Basal-like型(n=108)χ2值P值腫瘤最大徑(cm)69.69<0.01 <215571(47.7)38(39.2)25(34.7)21(19.5) 2～516258(38.9)45(46.4)31(43.1)28(25.9) >510920(13.4)14(14.4)16(22.2)59(54.6)淋巴結轉移3.510.32 陽性14043(28.9)31(32.0)23(31.9)43(39.8) 陰性286106(71.1)66(68.0)49(68.1)65(60.2)轉移13.96<0.01 內臟轉移8016(10.7)19(19.6)13(18.1)32(29.6) 非內臟轉移5023(15.4)11(11.3)9(12.5)7(6.5)

乳腺癌是北美女性癌癥的第二大死因，在我國該病的發病率也逐年增高。乳腺細胞系的增殖受甾體類固醇激素和肽類激素調節，雌激素能夠促進乳腺上皮細胞增生，有研究指出乳腺上皮細胞在致癌因素作用下會發生惡變，而雌激素-受體系統又會使惡變細胞獲得優勢生長，形成腫瘤[8]。雌激素會直接對含ER的乳腺癌細胞產生作用，對癌細胞基因的表達、表型特征進行調節，刺激癌細胞的自分泌，使生長因子水平得到提升，而降低抑制生長因子水平[9]。BMP-6是一種能夠在乳腺癌中表達的生長因子，有學者認為BMP-6是雌激素的選擇性調節基因，其表達量受雌激素劑量的控制[10]，亦有研究發現BMP-6與表皮生長因子具有相關性[11]。鑒于此，本研究對不同分子類型乳腺癌BMP-6水平進行觀察，結果顯示，RT-qPCR法測定的BMP-6 mRNA在癌旁組織及癌組織中均存在，但癌組織中BMP-6 mRNA表達水平明顯低于癌旁組織；且Luminal A型BMP-6 mRNA表達水平高于Basal-like型；免疫組織化學染色的結果與BMP-6 mRNA表達水平一致，Luminal A型BMP-6強陽性(+++)率高于Basal-like型。有研究指出，Luminal A型ER基因表達程度最高，且GATA3、XBP1、CKB、CK18等與雌激素相關的基因水平均有上調；Basal-like型ER、PR均為陰性[12]。由此可見，BMP-6水平與ER、PR可能存在一定的反饋性調節關系，有報道指出1/2ERE區域的BMP-6啟動因子BMP6 PLR的啟動子活性在10-7mol/L時，雌激素作用能夠提高60%[13]。張磊[14]通過對ER陽性的乳腺癌細胞MCF-7的72 h后半定量反轉錄PCR測定BMP-6表達水平發現，與ER陰性的乳腺癌細胞MDA-MB-231比較，MCF-7中的BMP-6表達水平明顯高于MDA-MB-231(P<0.05)；且雌激素10-5、10-7mol/L能夠促進BMP-6的表達(P<0.05)。結合本次觀察推測，BMP-6與雌激素的劑量相關性不僅體現于雌激素相關細胞，亦表現于乳腺癌的分子類型中，但本次觀察的Luminal B型、Her-2陽性型的BMP-6表達水平并未表現出組間差異，是否可以參考BMP-6區分乳腺癌類型尚有待大樣本觀察。

Ki-67表達水平是公認的腫瘤細胞增殖特異性指標，其表達指數和病理分級是評價腫瘤細胞分化程度、增殖活性的有效指標。劉更等[15]在對80例乳腺癌組織的BMP-6表達水平進行觀察時發現，Ki-67表達≤20%的BMP-6陰性率為55.17%，>20%且<40%的BMP-6陰性率為34.78%，≥40%的BMP-6陰性率為46.43%，兩組間有明顯差異(P<0.05)，BMP-6隨著Ki-67的增高而減弱。推測BMP-6可能廣泛參與了腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移的調控過程。有研究顯示BMP-6、BMP-7通過抑制P38信號途徑、類固醇硫酸酯的表達來抑制雌激素介導乳腺癌細胞的增殖[16]，也有學者認為BMP-6可以通過δEF1調控E-cadherin，進而實現對上皮間質轉移的抑制[17]。

從各型的病理特征看，Luminal A型腫瘤體積較小、轉移率較低且多非內臟轉移；Basal-like型腫瘤體積較大、內臟轉移率較高，預后較差。章樂虹等[18]對693例確診的乳腺癌患者進行不同分子亞型的轉移觀察，Luminal A型的無病生存率、總生存率均高，非內臟轉移率為7.84%，復發風險曲線低平，預后最好；Basal-like型無病生存率、總生存率均低，內臟轉移率為19.54%，復發風險曲線峰值高，出現時間早，本研究結果與之一致，均說明Luminal A型的預后較好。影響乳腺癌預后的因素較多，如化療方案、患者對治療的敏感性、術式、患者自身因素等，本次觀察的患者均在本院進行規范的手術及化療，各分型間的病理、預后特征主要是不同類型間的差異形成。國外有報道顯示，乳腺癌細胞系MDA-MB-453、BT-20和已經發生轉移的乳腺癌標本中均可檢測到低水平的BMP-6，且BMP-6具有抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲、遷移的作用，并認為BMP-6與乳腺癌轉移呈負相關[19]。王川[20]在對乳腺癌MCF-7細胞的觀察中發現，經過BMP-6處理后的細胞，可通過MAPK/P38/AP-1抑制基質金屬蛋白酶(matrix metallo proteinase，MMP)-9啟動子活性。在乳腺癌細胞中，MMP-9的水平越高，淋巴轉移率、復發率越高，由上述推測Luminal A型的高水平BMP-6表達或與其較好的預后相關。

在Luminal A型的轉移患者中，有11.40%(17/149)的患者發生了骨轉移，是4型中最高者。BMP-6包括23個氨基酸的N端信號肽和490個氨基酸的BMP-6前肽，前肽中有4個保守雙堿性氨基酸殘基的酶切點，該點在蛋白水解酶的作用下可產生具有139個氨基酸的活性成熟肽，分泌的BMPs成熟肽可形成同源二聚體或異源二聚體，其中的異源二聚體的誘骨活性較強[21]，或許是Luminal A型易發生骨轉移的重要機制。

綜上所述，BMP-6在乳腺癌不同分子類型中的表達水平存在差異，其中預后較好的Luminal A型BMP-6表達水平較高，Basal-like型表達水平較低，臨床或可對不同分子類型的乳腺癌患者采取不同方案的BMP-6治療，但這仍需進行大量的實驗及臨床研究。本次觀察采選病例地域有限，在下一步研究中擬對不同民族、地區的乳腺癌患者進行分型觀察，為BMP-6的臨床應用提供參考。

作者貢獻：丁梅進行試驗設計與實施、撰寫論文、成文并對文章負責；王增輝、楊艷玲、馬振玲、李宗富、李潤華進行試驗實施、評估、資料收集；胡芬進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：賈萌萌)

Clinical Significance of the Expression of Bone Morphogenetic Proteins 6 in Different Types of Breast Cancer

DINGMei，HUFen，WANGZeng-hui，etal.

TangshanXieheHospital，Tangshan063000，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of bone morphogenetic proteins 6(BMP-6)of different types of breast cancer and its relation with clinical pathological characteristics.MethodsFrom January 2013 to March 2015，we enrolled 426 females patients who were diagnosed with breast cancer by surgery and pathology in the Department of General Surgery of Tangshan Xiehe Hospital.Among these patients，there were 149 Luminal A patients，97 Luminal B patients，72 Her-2 positive patients and 108 Basal-like patients.Real-time fluorescent quantitative PCR was adopted to detect the mRNA expression of BMP-6 of different molecular types，and immunohistochemistry assay was used to detect the protein expression of BMP-6 of different molecular types.Comparison of clinical features among different molecular types of breast cancer patients was made.ResultsSignificant differences were noted in BMP-6 mRNA expression level among different molecular types of cancer tissues(P<0.05)；BMP-6 mRNA level of Basal-like patients was lower than that of Luminal A patients(P<0.05).Different molecular types of cancer tissues all had lower BMP-6 mRNA level than para-cinoma tissues(P<0.01).Different molecular types of cancer tissues were significantly different in the protein expression level of BMP-6(χ2=19.01，P=0.02)；the negative rate(-)of Luminal A type was lower than that of Basal-like type(χ2=5.17，P=0.002)；the positive(+++) rate of Luminal A was higher than Basal-like type(χ2=8.84，P<0.001).Different molecular types of patients were not significantly different in the lymphatic metastasis rate(P>0.05)，and were significantly different in tumor size and viscera metastasis rate(P<0.01)；Basal-like patients had higher viscera metastasis rate than Luminal A patients(χ2=14.71，P<0.001).ConclusionDifferences exist in the expression of BMP-6 among breast cancer tissues of different molecular types，so different BMP-6 treatment regimens can be adopted for different types of breast cancer patients in clinical practice.

【Key words】Breast neoplasms；Bone morphogenetic protein 6；Molecular typing

(收稿日期：2015-07-06；修回日期：2015-12-20)

【中圖分類號】R 737.9

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.11.016

通信作者：胡芬，063000河北省唐山市，華北理工大學生命科學院；E-mail：ihufen@126.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81302323)——BMP-6調控mmp表達抑制乳腺癌細胞轉移的功能和機理研究(2013-57-0352)；河北省自然科學基金資助項目(c2014209140)——BMP-6調控mmp-1表達抑制乳腺癌細胞轉移的功能和機制研究