焦油、尼古丁和瑞舒伐他汀對人臍靜脈內皮細胞表達內皮細胞蛋白C受體的影響

王 震，魏玉杰，賴 斌，劉惠亮

焦油、尼古丁和瑞舒伐他汀對人臍靜脈內皮細胞表達內皮細胞蛋白C受體的影響

王 震，魏玉杰，賴 斌，劉惠亮

目的 探討焦油、尼古丁和瑞舒伐他汀對人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）表達內皮細胞蛋白C受體（endothelial cell protein C receptor,EPCR）的影響。方法 體外分離培養HUVECs并傳代至4～6代，將其分為對照組，50 mg/L焦油組，10-4mol/L尼古丁組，10-5mol/L瑞舒伐他汀組。各組分別孵育6 h和24 h后，收集細胞，使用流式細胞術和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）分別檢測并比較細胞EPCR蛋白表達和胞漿中信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）水平。結果 （1）與同時間點對照組比較，EPCR蛋白表達在焦油組孵育6 h（t=29.513，P＜0.001）及24 h（t=41.759，P＜0.001）后均明顯上調，差異有統計學意義；而尼古丁組、瑞舒伐他汀組均無明顯變化。（2）與同時間點對照組相比，mRNA表達量在焦油組孵育6 h（t=20.753，P＜0.001）和24 h（t=19.897，P＜0.001）后均明顯增加；而尼古丁組、瑞舒伐他汀組均無明顯變化。結論 焦油可上調HUVECs表面EPCR的表達，而尼古丁和瑞舒伐他汀對EPCR的表達無影響。

焦油；尼古丁；瑞舒伐他汀；內皮細胞蛋白C受體

EPCR是存在于細胞膜表面的跨膜蛋白，可與蛋白質C特異性結合后將其呈遞給鄰近的凝血酶/血栓調節蛋白復合物，從而加快蛋白質C的激活。吸煙作為冠心病的危險因素之一，近年有研究發現香煙煙霧提取物可引起可溶性EPCR含量升高及膜聯EPCR mRNA減少，導致機體凝血功能障礙，血栓形成[1]。但香煙中所含物質種類較多，具體是哪些成分影響了EPCR的表達尚未見報道。作為香煙主要有害組分之一，尼古丁可在吸煙者的血清中檢測到，Fahim等[2]發現尼古丁可促進小鼠腦部微血管內血栓形成。既往研究發現降低香煙中焦油的含量，可使冠心病發病風險降低，但亦有其他研究未發現這一效應[3]，故焦油在冠心病發生發展中的作用有待進一步研究。此外有研究表明，他汀類藥物除具有降脂作用外，還有抗凝作用[1,4]。故本研究擬選用尼古丁、焦油、瑞舒伐他汀孵育HUVECs，以探索三者對HUVECs 表面EPCR表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVECs取自武警某部三甲醫院婦產科，焦油（中國科學院煙草研究所），瑞舒伐他汀（中國軍事醫學科學院微生物流行病研究所），尼古丁（美國Sigma公司），內皮細胞培養液（endothelial cell medium，ECM） （北京裕恒豐科技有限公司），胎牛血清（fetal calf serum，FBS） （美國Hyclone公司），胰蛋白酶和I型膠原酶（美國Gibco公司），羊抗鼠IgG FITC抗體、鼠抗人EPCR抗體（英國abcam公司），RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，反轉錄試劑盒及qRTPCR試劑盒（日本TaKaRa公司），內參β-actin和引物（上海生工生物工程公司）。

1.2 方法

1.2.1 焦油溶液、瑞舒伐他汀溶液的制備 10 mg/ml焦油原液：焦油經甲醇溶液溶解后分裝，并于4℃保存。將一定量的瑞舒伐他汀原粉倒入盛有雙蒸水的燒杯中，使用磁力攪拌器使其完全溶解，最終配置成10-2mol/L溶液，經0.22 μm濾器過濾除菌后于4℃保存。

1.2.2 HUVECs的分離培養與分組 取婦產科剖宮產的無菌臍帶，在超凈臺內進行以下操作：將臍帶置于無菌托盤，用生理鹽水沖洗干凈，于臍帶兩頭找到臍靜脈并于一端固定結扎三通管（入口），采用生理鹽水經三通管沖洗臍靜脈內腔，至出口流出無色透明液體，再于臍靜脈另外一端固定結扎另外一個三通管（出口），注入0.1% I型膠原酶，于37℃無菌生理鹽水中靜置消化20 min后收集消化液，1000 r/min離心5 min后棄上清，加入含10%FBS的ECM，按1×105/ml的密度接種于25 cm2培養瓶中，37℃ 5%CO2孵箱內培養。待細胞融合至90%，吸出培養液，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，以1×105/ml的密度接種至6孔板孵育過夜，并隨機分為4組：空白對照組，50 mg/L焦油組，10-4mol/L尼古丁組，10-5mmol/L瑞舒伐他汀組，每組設3個平行復孔，均孵育6 h和24 h，實驗重復3次。

1.2.3 流式細胞術 提取六孔板內細胞，按試劑盒步驟說明操作：（1）分組培養結束后，棄培養液，加入750 μl 0.25%胰酶消化細胞，加入2 ml含1%FBS磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline,PBS）吹打細胞至懸浮狀態，轉移至流式管；（2）500 r/min離心5 min，使用含1%FBS的PBS洗滌兩次，離心后棄上清加入抗體稀釋液；（3）每管加入1 μl鼠抗人EPCR單克隆抗體，手指輕彈流式管底部混勻細胞，4℃避光靜置30 min；（4）1%FBS的PBS洗滌兩次后，加入抗體稀釋液和1 μl羊抗鼠IgG FITC二抗，手指輕彈流式管底部混勻細胞，4℃避光靜置30 min；（5）1%FBS的PBS洗滌兩次，加入300 μl含1%FBS的PBS，使用流式細胞儀檢測細胞表面EPCR的表達，每次計數30 000個細胞，實驗重復3次。1.2.4 qRT-PCR 提取六孔板內細胞mRNA，經紫外分光光度計測定樣品的濃度和純度（A260/A280=1.8～2.0）。EPCR上游引物5'-CACCCTGCAGCAGCTCAATGC-3'，下游引物5'-ACATCGCCGTCCACCTGTGC-3'，β-actin 上游引物5'- GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3'，下游引物5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'。qRT-PCR反應條件：95℃（5 min）預變性；95℃（15 s），55℃（20 s），72℃（20 s）運行40個循環；95℃（15 s），59℃（1 min）溶解曲線。采用美國ABI公司實時熒光定量PCR儀VIIA7配套軟件進行數據采集，各組結果以公式2-ΔΔCT表示相對表達量，每組設立3個平行復孔，實驗重復3次。

1.3 統計學處理 采用SPSS軟件包進行統計分析，計量資料以±s表示，各組與同時間點對照組比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 尼古丁、焦油和瑞舒伐他汀對EPCR蛋白表達的影響 各組分別孵育6 h和24 h后，與同時間點對照組相比，尼古丁組和瑞舒伐他汀組EPCR蛋白表達均上調，但差異均無統計學意義；而焦油組孵育6 h（t =29.513，P＜0.001）及24 h（t=41.759，P＜0.001）后細胞EPCR蛋白表達均明顯上調，差異有統計學意義，見表1。

表1 各組HUVECs表面EPCR細胞陽性表達情況（x ±s；n=3）

2.2 尼古丁、焦油和瑞舒伐他汀對EPCR mRNA表達的影響 使用qRT-PCR定量分析各組EPCR mRNA水平的變化，統計各組2-ΔΔCT值的變化，并設立對照組數值為1。結果如圖1所示，分別孵育6 h和24 h后，與同時間點對照組相比，尼古丁組和瑞舒伐他汀組EPCR mRNA含量差異均無統計學意義；而焦油組孵育6 h（t=20.753，P＜0.001）和24 h（t=19.897，P＜0.001）后mRNA表達量均明顯增加，差異有統計學意義。

圖1 各組人臍靜脈內皮細胞內EPCR mRNA相對水平比較注：與同時間點對照組相比，①P＜0.05

3 討 論

蛋白C抗凝系統在人體內發揮著重要作用，其中EPCR參與蛋白C激活和活化蛋白C所介導的蛋白酶活化受體的激活，從而發揮相應的細胞效應[5]。此外，亦有研究表明EPCR可與活化的VII因子結合，發揮內皮細胞間屏障保護功能[6]。EPCR可表達于血管內皮細胞、單核細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞等[7]。作為人體較易獲得的細胞種類之一，Lee等[8]使用烏茸菌提取物polyozellin探討其對HUVECs表面EPCR脫落的影響，樊芳芳等[1]亦使用HUVECs探討香煙提取物對EPCR表達的影響，因此本研究選用HUVECs作為實驗細胞。

Zhang等[9]使用0.01～100 μmol/L尼古丁分別孵育HUVECs 0、8、24 h，發現尼古丁可明顯促進HUVECs增生，且呈時間和濃度依賴性，因而本研究直接選用10-4mol/L尼古丁孵育HUVECs，并選擇6、24 h兩個時間點，但發現尼古丁對EPCR的表達無影響，而焦油可上調EPCR的表達，從而可能增強人體的抗凝作用，這與吸煙易致血栓形成的結論不一致[10]，因此其上調效應是短期保護反應還是長期效應仍需進一步研究驗證。至于焦油上調EPCR表達的具體機制，既往研究表明，葡萄糖和轉錄因子Fli1的基因敲除均可調節HUVECs表面EPCR表達[11]；絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）也可能參與了其表達調節，其中脂多糖可通過P38 MAPK通路下調EPCR表達[12]；腫瘤壞死因子α等細胞因子可能通過增加c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK） MAPK下調EPCR的表達[13]。但焦油是否也通過該通路或其他信號通路上調EPCR仍有待研究。

他汀類藥物因其降脂作用而被臨床廣泛應用于冠心病等疾病的治療，但隨著研究深入，Yang等[14]發現他汀類藥物可通過上調Krüppel樣轉錄因子的表達而上調血栓調節蛋白的表達，發揮抗凝作用。Landsberger等[15]使用10-8～10-5mol/L瑞舒伐他汀孵育HUVECs 8～12 h后，發現內皮型一氧化氮合成酶表達明顯增加，且與瑞舒伐他汀的濃度呈正相關。故本研究選用10-5mol/L瑞舒伐他汀分別孵育內皮細胞6、24 h，但EPCR的表達量均無明顯變化，這與文獻[1]的研究結果有所矛盾，可能是不同他汀因分子結構差異較大，導致其降脂以外的多效性有所差別，亦有可能是因孵育時間較短，EPCR的表達所需時間不足，該結論仍需進一步驗證。

綜上所述，本研究發現焦油可上調EPCR的表達，而尼古丁和瑞舒伐他汀對EPCR的表達無影響，該結論與吸煙是心血管疾病的危險因素這一點不符，這可能是內皮細胞的急性應激保護，具體機制有待進一步研究。此外，因時間有限，本研究未深入探索EPCR的表達是否受尼古丁、焦油和瑞舒伐他汀的濃度及孵育時間的影響，今后的研究中需進一步驗證。

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（2016-01-07收稿 2016-03-08修回）

（責任編輯 付 輝）

Effects of tar,nicotine and rosuvastatin on expression of EPCR in human umbilical vein endothelial cells

WANG Zhen,WEI Yujie,LAI Bin,and LIU Huiliang.Department of Cardiology,General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces,Beijing 100039,China

LIU Huiliang,E-mail:huiliangl531@163.com

Objective To explore the effects of tar,nicotine and rosuvastatin on expression of endothelial cell protein C receptor (EPCR)in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).Methods HUVECs were isolated and cultured in vitro,and were randomly divided into control group,50 mg/L tar group,10-4mol/L nicotine group,10-5mol/L rosuvastatin at passage 4 to 6.All groups were incubated for 6 h and 24 h,then collected the HUVECs.Flow cytometry and quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR)were respectively used to detect and compare expression of EPCR protein and the EPCR level of messenger ribonucleic acid (mRNA)of in each HUVECs group.Results (1)Compared with control group at the same time point,expression of EPCR protein in 50 mg/L tar group after incubated for 6 h (t=29.513，P＜0.001)and 24 h (t=41.759，P＜0.001)were both increased,and the differences were statistically significant;but in 10-4mol/L nicotine group and 10-5mol/L rosuvastatin group had no obvious change.(2)Compared with control group at the same time point,expression of EPCR mRNA in 50 mg/L tar group after incubated for 6 h (t=20.753，P＜0.001)and 24 h (t=19.897，P＜0.001)were significantly increased;but there were no significant change in 10-4mol/L nicotine group and 10-5mol/L rosuvastatin group.Conclusions Tar has the effect of up-regulating the expression of EPCR in HUVECs,whereas nicotine and rosuvastatin have no effect on the expression of EPCR in HUVECs.

tar;nicotine;rosuvastatin;endothelial cell protein C receptor

R363

10.13919/j.issn.2095-6274.2016.04.005

王 震，碩士研究生在讀，E-mail:wzlunwen@126.com

100039 北京，武警總醫院心內科

劉惠亮，E-mail:huiliangl531@163.com