PD—ECGF在CEA術后再狹窄血管中的表達及其與管腔狹窄程度的相關性研究

徐敬軒　欒新平

【摘要】 目的 探討血小板衍生內皮細胞生長因子（PD-ECGF）在頸動脈粥樣硬化剝脫術（carotid endarterectomy， CEA）術后再狹窄血管中的表達及其與管腔狹窄程度的相關性。方法 20只新西蘭清潔級白兔， 隨機分為對照組（5只）和實驗組（15只）， 建立兔頸動脈再狹窄模型， 取材后行免疫組織化學染色， 與對照組相比， 觀察實驗組PD-ECGF的表達， 并觀察其陽性表達強度與管腔狹窄程度的關系。結果 實驗組PD-ECGF陽性表達（>2分）13例， 陰性（≤2分）2例， 對照組陽性表達3例， 陰性12例， 對比差異有統計學意義（P<0.01）；PD-ECGF陽性表達強， 其管腔狹窄程度較輕， 表達較弱時則相反。結論 PD-ECGF可能是血管再狹窄形成諸多因素中的一種起保護作用的因子， 可促進內皮細胞的遷移， 從而抑制血管平滑肌的增殖。

【關鍵詞】 血小板衍生內皮細胞生長因子；頸動脈粥樣硬化剝脫術；再狹窄血管

CEA是預防和治療缺血性腦卒中的主要手術方式， 但術后仍有再狹窄的發生， 周定標[1]報道發生率為1%～31%， 如何有效的預防已成為困擾臨床醫生的一大難題。PD-ECGF是血小板中發現的一種內皮細胞生長因子， 本研究通過對20只新西蘭白兔進行分組實驗， 從而探討該因子在CEA術后再狹窄血管中的表達及其與管腔狹窄程度的相關性， 現報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 新西蘭清潔級白兔20只， 隨機分為對照組（5只）和實驗組（15只）。其中對照組給予正常喂養6周后取材， 每只在頸動脈不同部位取3份， 共15份標本作為對照；實驗組給予高脂喂養2周， 形成斑塊后行CEA術， 術后繼續高脂喂養4周， 待再狹窄形成后取材。

1. 2 儀器與試劑 手術顯微鏡及顯微器械， 愛惜康可吸收縫線， LipofectamineTM2000；地高辛精（Dig-11-ddUTP）；PD-ECGF單克隆抗體；攜帶PD-ECGF質粒的克隆；大腸桿菌DH5a；分子克隆工具酶；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒；質粒抽提試劑盒；SP試劑盒；分析醇。

1. 3 方法 ①實驗組頸動脈再狹窄模型建立方法：給予1 g膽固醇/（d·只）， 喂養2周。用3%戊巴比妥鈉3 mg/kg， 耳緣靜脈麻醉。頸部剃毛， 于甲狀軟骨下1 cm處， 沿頸白線切開皮膚約4 cm， 用顯微剝離子在動脈壁中膜層分離， 完整切除已分離的內膜， 用縫合線連續縫合動脈切口， 縫合后動脈直徑應不低于原血管直徑的85%， 用不含肝素的生理鹽水充盈管腔， 放開血管夾， 檢查無明顯出血后， 將頸總動脈放回原位， 縫合頸闊肌和頸部皮膚切口。生存動物術后繼續給予高膽固醇喂養4周。②血管標本的制備：術后實驗組高脂喂養4周， 麻醉試驗動物后在無菌條件下銳性切下狹窄處血管約1.5 cm， 置冰上用肝素鹽水沖洗管腔內血液， 4%多聚甲醛固定。③原位雜交組織化學染色檢測PD-ECGF的陽性表達：用Dig-11-ddUTP修飾合成好的寡核苷酸探針并純化。將各組石蠟包理切片浸入二甲苯10 rain移除石蠟， 用30 ?l 0.4 ng/?l的PD-ECGF mRNA的寡核苷酸探針液加在切片上， 過夜；滴加酶標地高辛抗體（1：500）， 37℃30 min；加顯色液后顯色；二甲苯透明， DPX封固。④病理學檢查：取血管組織0.25 cm， 將其連續切片， 厚度為0.4 ?m， 行蘇木素-伊紅（HE）染色， 計算機病理圖像分析系統下觀察管腔狹窄率=（1-現存管腔面積/內彈力膜以下面積）×100%。根據NASCET狹窄程度分級：輕度<30%， 中度30～69%， 重度70～99%。

1. 4 判定標準 顯微鏡下觀察， 陽性信號為紫藍色顆粒狀沉淀物分布于細胞漿中， 計數顯微高倍視野中陽性表達， 強度評分標準：無染色記0分；輕度染色記1分；中度染色記2分；強染色記3分。細胞比例評分標準：無染色記0分；<25%染色記1分；25%～50%染色記2分；>50%染色記3分。評分之和>2分， 則為PD-ECGF表達陽性， ≤2分則為陰性。

1. 5 統計學方法 采用SPSS16.0統計學軟件進行數據統計分析。計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

實驗組無染色1例， 輕度染色1例， 中度染色2例， 強染色11例；細胞比例：無染色1例， <25% 4例， 25%～50% 2例， >50% 8例。對照組無染色13例， 輕度染色1例， 中度染色1例， 無強染色；細胞比例：無染色13例；<25%2例；無>25%染色。實驗組陽性表達（>2分）13例， 陰性（≤2分） 2例； 對照組陽性表達3例， 陰性12例， 比較差異有統計學意義（χ2=13.39， P<0.01）。對實驗組管腔狹窄程度觀察結果表明， PD-ECGF陽性表達強， 其管腔狹窄程度較輕， 表達較弱時則相反。

3 討論

PD-ECGF在血管生成領域中已被業界學者關注。目前血小板中已知的生長因子如PDGF， 表面生長因子（EGF）等， 均未發現具有促進內皮生長作用， 而PD-ECGF因其釋放條件不同， 是血小板中目前發現唯一的內皮細胞生長因子[2]， 在體內血管生成中起著重要作用。

CEA術后造成管腔再狹窄的原因是術后內膜斑塊被切除， 內皮細胞缺失， 啟動了血栓形成、炎癥反應、平滑肌細胞增殖和遷移等過程， 導致再狹窄的發生。其中心環節是血管平滑肌的過度增殖， 有學者通過體外實驗已證實PD-ECGF具有刺激和增強內皮細胞遷移特性， 進而修復損傷、 維持血管穩定[3]。國外腫瘤研究的相關文獻已證實， PD-ECGF可促進腫瘤血管內皮細胞遷移， 而并未加重其對周圍的浸潤[4]。國內也有學者證實， PD-ECGF能增強內皮細胞和平滑肌細胞的遷移， 從而抑制平滑肌細胞的過度增殖[3]。

作者在前期工作中， 對頸動脈粥樣硬化斑塊形成的血管中PD-ECGF的表達進行觀察和對比， 已初步證實PD-ECGF在頸動脈粥樣硬化斑塊形成的血管中呈陽性表達， 但在CEA術后再狹窄形成的血管中如何， 尚未查閱到相關報道。本研究通過建立新西蘭兔頸動脈CEA術后再狹窄動物模型， 與對照組進行對比， 觀察再狹窄形成的血管中PD-ECGF的陽性表達情況， 同時結合病理， 進行再狹窄程度的觀察。研究結果顯示，PD-ECGF在再狹窄形成的血管中有陽性表達， 在其形成的過程中發揮一定的作用。而通過與病理檢查所示狹窄程度的觀察發現， 陽性細胞數百分數越低者， 血管管腔狹窄程度越嚴重， 而陽性細胞數百分數越高者， 管腔反而輕度狹窄， 說明PD-ECGF可能是血管再狹窄形成諸多因素中的一種起保護作用的因子， 可促進內皮細胞的遷移， 從而抑制血管平滑肌的增殖。

總之， PD-ECGF可能抑制CEA術后血管再狹窄形成， 為開展基因轉染技術研究提供理論依據及實驗基礎， 因本研究樣本量有限， 尚缺乏說服力， 將在隨后開展的寡核苷酸轉染研究中進一步證實。

參考文獻

[1] 周定標.頸動脈內膜切除術.北京：人民軍醫出版社， 2005： 276-280.

[2] 李冰， 尚濤.血小板衍生內皮細胞生長因子的研究進展.國際婦產科學雜志， 2008， 35（2）：86-88.

[3] 朱晉坤， 毛華， 尹揚光， 等.血小板源性生長因子和血小板源性內皮細胞生長因子在內皮細胞和血管平滑肌細胞中的作用研究.中國全科醫學， 2015， 9（9）：1023-1028.

[4] Bijnsdorp IV， Capriotti F， Kruyt FA， et al. Thymidine phosphorylase in cancer cells stimulates human endothelial cell migration and invasion by the secretion of angiogenic factors. Br J Cancer， 2011， 104（7）：1185-1192.

[收稿日期：2015-12-07]