金黃色葡萄球菌鑒定及spa基因多態(tài)性分析

曾德興楊 慧黃麗雯

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金黃色葡萄球菌鑒定及spa基因多態(tài)性分析

曾德興1楊 慧2黃麗雯3

【摘要】目的 鑒定分離自龍崗區(qū)的金黃色葡萄球菌，探討使用金黃色葡萄球菌spa基因?qū)赀M(jìn)行多態(tài)性分析的價(jià)值。方法 在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查找金黃色葡萄球菌spa基因序列，并設(shè)計(jì)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)分型，建立新的金黃色葡萄球菌分型方法，并與常規(guī)金黃色葡萄球菌spa基因分型和脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）分型法進(jìn)行比較，構(gòu)建龍崗區(qū)金黃色葡萄球菌分型數(shù)據(jù)庫(kù)。結(jié)果 5例患者抗結(jié)核治療前后前鼻腔定植的金黃色葡萄球菌spa分型相同，結(jié)果與PFGE結(jié)果一致；5例患者定植的金黃色葡萄球菌spa分型分別為：t795、t179、t189、t758和t796，其中t795、t758和t796為新發(fā)現(xiàn)的分型。結(jié)論 spa分型是一個(gè)較好的金黃色葡萄球菌快速基因分型方法。

【關(guān)鍵詞】葡萄球菌；SPA；基因

1龍崗區(qū)坂田街道預(yù)防保健所，廣東深圳 518129

2龍崗區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東深圳 518129

3龍崗區(qū)龍崗街道預(yù)防保健所，廣東深圳 518129

金黃色葡萄球菌又稱為嗜肉菌，是人類較重要的病原菌。由于金黃色葡萄球菌可導(dǎo)致院內(nèi)感染，進(jìn)而影響患者的身體健康，故亟需對(duì)其進(jìn)行快速及準(zhǔn)確分型，以減少院內(nèi)感染的發(fā)生。Kumari等[1]采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行分型，但是該方法的操作步驟較復(fù)雜，且所使用的設(shè)備較昂貴，難以在實(shí)驗(yàn)室中普及，限制了其應(yīng)用?；蚨鄳B(tài)性方法與脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）分型法相比，具有較好的穩(wěn)定性及重復(fù)性，且快速易用，容易得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以滿足實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)要求[2]，然而目前國(guó)內(nèi)鮮有相關(guān)報(bào)道。本研究就基于金黃色葡萄球菌spa基因的多態(tài)性進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 選取來(lái)源于臨床、食物中毒及食品監(jiān)測(cè)處的金黃色葡萄球菌菌株10株，其中5株來(lái)源于結(jié)核病患者的鼻拭子，3株來(lái)源于食品，1株來(lái)源于食物中毒，1株來(lái)源于腹瀉標(biāo)本。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 spa基因分型 將各菌株置于胰酶大豆瓊脂平板接種，并過(guò)夜培養(yǎng)，將5個(gè)典型的菌落置于普通裂解液中；然后加入溶葡萄球菌素和RNA酶，使終濃度為100 μg/ml，煮沸10 min，以1000 r/min離心10 min（離心半徑為8.7 cm），將上清液作為PCR模板。根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增spaX區(qū)的引物：PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃45 s，共30個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸10 min，4℃保護(hù)，并在紫外光燈下觀察并記錄PCR產(chǎn)物。spa分型采用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ridom.de/spaserver/），測(cè)序結(jié)果中所使用的重復(fù)編碼判度根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)獲得[3]。

1.2.2 PFGE ①將菌懸液與等量低熔點(diǎn)瓊脂糖混勻，并制作成塊；②待蛋白酶K過(guò)夜消化后，其染色體DNA的原位消化則采用Sma Ⅰ內(nèi)切酶；③使用脈沖電泳儀，型號(hào)為CHEF-Mapper，根據(jù)美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心（CDC）TENOVER等方法判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 治療前spa基因擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果 5例患者治療前分離的菌株A和治療后分離的菌株B的spa基因擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別相同。

2.2 spa基因分型結(jié)果 結(jié)果可見(jiàn)，spa基因重復(fù)序列數(shù)為6～10個(gè)。菌株1A和1B、2A和2B、3A和3B、4A和4B、5A和5B具有相同的重復(fù)序列。分型結(jié)果為：2A和2B為t179型，3A和3B為t189型；1A和1B、4A和4B、5A和5B的spa型為新發(fā)現(xiàn)的基因型，根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)分別定為t795、t758 和t796型。見(jiàn)表1。

表1　5例患者治療前后的spa重復(fù)編碼特征、重復(fù)數(shù)長(zhǎng)度及分型

2.3 PFGE結(jié)果 由表1可見(jiàn)，1A與1B的條帶相同，以此類推，2A、3A、4A、5A分別與2B、3B、4B、5B的條帶相同。5例患者治療前后所分離菌株類型是相同的，但所攜帶菌株的類型則不同。

3 討論

金黃色葡萄球菌是一種人畜共患病的重要致病菌，其暴發(fā)流行嚴(yán)重威脅著人類健康。減少和控制金黃色葡萄球菌感染的一個(gè)重要策略是明確流行環(huán)節(jié)，切斷傳播途徑，因此，如何選擇可靠的分型方法，對(duì)于院內(nèi)感染的控制有重要作用，但目前使用的各種金黃色葡萄球菌分型方法各有缺點(diǎn)。高分辨率熔解曲線（HRM）技術(shù)是在實(shí)時(shí)熒光PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的實(shí)時(shí)定量新技術(shù)，是目前最好的一種高通量突變掃描和基因分型技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、快速、低成本、靈敏度及特異度高、閉管操作、對(duì)樣品無(wú)污染、后期數(shù)據(jù)分析簡(jiǎn)單、易懂等優(yōu)點(diǎn)；本研究擬采用HRM技術(shù)研發(fā)出針對(duì)金黃色葡萄球菌spa基因的新型分子分型方法，該項(xiàng)研究的最終成果將提供一種新的快速、準(zhǔn)確、低成本的金黃色葡萄球菌分型方法。HRM技術(shù)在臨床檢驗(yàn)、食品檢驗(yàn)、商品檢驗(yàn)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。本課題在建立新的金黃色葡萄球菌分子分型方法的同時(shí)構(gòu)建龍崗區(qū)金黃色葡萄球菌數(shù)據(jù)庫(kù)，以實(shí)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)觀察和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，可為金黃色葡萄球菌所致食源性疾病的流行病學(xué)調(diào)查和準(zhǔn)確溯源提供主要技術(shù)依托；通過(guò)與其他實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)比較，可為金黃色葡萄球菌的監(jiān)測(cè)、預(yù)警、控制作出貢獻(xiàn)，有效降低金黃色葡萄球菌的社區(qū)獲得性感染和院內(nèi)感染。

蛋白A是從A型金黃色葡萄球菌中分離而得到的細(xì)胞壁蛋白，可形成含有A蛋白、抗原及抗體的復(fù)合物。蛋白A的spa基因長(zhǎng)約為2150 bp，包括X區(qū)、Fc結(jié)合區(qū)及其C末端。其中X區(qū)中又包含2～15個(gè)重復(fù)序列，其長(zhǎng)度大約為24 bp，有高度多態(tài)性[2,4-5]。由于spa分型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果較容易獲取及解釋，且能夠利用數(shù)據(jù)庫(kù)了解不同地區(qū)的菌株流行情況，從而為其提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并容易進(jìn)行序列比對(duì)和分型。

綜上所述，從PFGE結(jié)果看，每例患者治療前后分離的2株菌（A和B）的條帶完全相同，雖然利福平對(duì)治療前后分離菌株的最小抑菌濃度差別明顯，但每例患者治療前后分離到的菌株來(lái)源相同。此外，spa擴(kuò)增結(jié)果提示患者治療前后的菌株擴(kuò)增產(chǎn)物相同，提示spa分型是一個(gè)較好的金黃色葡萄球菌快捷基因分型方法。

參考文獻(xiàn)

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【中圖分類號(hào)】R378.11

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.04.090