VGX-1027對小鼠心臟移植物缺血再灌注損傷的保護作用

戴駒驥，鄭祥韜，傅紅興，周蒙滔（.溫州醫科大學附屬第一醫院　普外科，浙江　溫州　3505；.溫州醫科大學　藥學院，浙江　溫州35035）

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VGX-1027對小鼠心臟移植物缺血再灌注損傷的保護作用

戴駒驥1，鄭祥韜1，傅紅興2，周蒙滔1
（1.溫州醫科大學附屬第一醫院普外科，浙江溫州325015；2.溫州醫科大學藥學院，浙江溫州325035）

[摘 要]目的：探究VGX-1027對小鼠心臟移植物缺血再灌注損傷的保護作用。方法：取40只C57BL/6小鼠隨機分為2組，分別為單純心臟移植組和心臟移植+VGX-1027治療組，每組各20只。移植術后24 h獲取供心，通過HE染色及CD3、CD4和CD8免疫組織化學觀察移植心臟的病理學改變；Western blot法檢測移植術后供心caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表達；ELISA法檢測移植術后小鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達。結果：與單純心臟移植組相比，心臟移植+VGX-1027治療組炎癥浸潤明顯減少，免疫組織化學顯示CD3+T細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞的浸潤數量明顯減少；Western blot法檢測結果顯示Bax和caspase-3的蛋白表達量顯著減少（P＜0.05），Bcl-2蛋白的表達量顯著增加（P＜0.05）；ELISA法結果顯示血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6的表達水平顯著下降（P＜0.05）。結論：VGX-1027可以通過抑制移植心臟的凋亡及炎性因子的釋放減輕對心臟移植物缺血再灌注的損傷。

[關鍵詞]心臟移植；缺血再灌注損傷；VGX-1027；C57BL/6小鼠

近二十年來，心力衰竭（簡稱心衰）的發病率越來越高[1]。雖然目前有很多針對心衰的治療方法，但心臟移植依然是目前終末期心衰患者的最佳選擇，可明顯提高心衰患者的長期生存率[2]。

心臟移植的療效與心臟移植過程中心肌組織的缺血再灌注密切相關，移植心臟缺血再灌注損傷可引起早期移植物功能不全及晚期并發癥從而導致移植失敗[3]，目前臨床上亦無有效的應對方法。因此，尋找一種能特異有效地減少心臟移植后缺血再灌注損傷的藥物對臨床治療意義重大。VGX-1027是Toll樣受體4（TLR4）的特異性拮抗劑[4]，它能通過抑制TLR4的激活來降低T淋巴細胞的增殖及炎癥因子的表達[5]，具有安全性高、不良反應少等優點[6-7]。本研究將其應用于近交系小鼠的心臟移植，考察其對心臟移植物缺血再灌注損傷的保護作用。

1　材料和方法

1.1試劑 Western blot檢測試劑盒購自美國Bio-Rad公司；CD3、CD4、CD8抗體購自美國eBioscience公司；caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司；炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 ELISA檢測試劑盒購自美國R＆D公司；NP-40蛋白裂解液和VGX-1027試劑購自美國Sigma公司。1.2 實驗動物 健康BALB/c小鼠作為供體，健康C57BL/6小鼠作為受體，各40只，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。將C57BL/6小鼠隨機分成2組，分別為單純心臟移植組和心臟移植+VGX-1027（濃度為70 mg/kg）治療組（術前1 h通過尾靜脈注射給藥），每組各20只。

1.3小鼠移植心臟缺血再灌注損傷模型建立 采用0.3%的戊巴比妥鈉（濃度為0.1 mL/kg）將供體小鼠麻醉，取供心置于4 ℃心臟保護液（含110 mmol/L NaCl、25 mmol/L KCl、22 mmol/L NaHCO3、16 mmol/L MgCl2、0.8 mmol/L CaCl2和40 mmol/L葡萄糖）中[8]，2 h后進行心臟移植。

麻醉受體小鼠，應用Cuff技術建立小鼠頸部異位心臟移植模型：游離右頸總動脈，用血管夾夾閉近心端，結扎并切斷遠心端，將近心端穿過預先準備好的cuff管，并將穿出cuff管部分的動脈翻轉過來套在cuff管上并用8-0的絲線結扎固定，同樣方法將右頸外靜脈套在cuff管上，將供心肺動脈與受體小鼠右頸外靜脈的cuff管進行吻合，并結扎固定，同樣方法將供心主動脈與受體小鼠右頸總動脈的cuff管吻合，松開夾閉右頸外靜脈和右頸總動脈的血管夾，可見血管和心臟充血，檢查血管連接處有無血液滲漏，完成小鼠心臟移植手術。術后肌肉注射青霉素500 U/10 g，24 h后移植心臟仍有搏動者標志移植成功[9-10]。

1.4組織形態學分析 取供心標本置于4%多聚甲醛里固定，梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，脫蠟后行HE染色，觀察移植心臟組織炎癥浸潤情況。應用免疫組織化學檢測移植心臟組織中的CD3+T細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞浸潤情況。石蠟切片脫蠟及水化后抗原修復，血清封閉，一抗過夜。第2天加二抗37 ℃孵育30 min，然后滴加鏈霉親和素-生物素復合物（strept avidin-biotin complex，SABC）37 ℃下作用30 min，最后加DAB顯色后復染，即可脫水封片觀察CD3+T細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞浸潤情況。

1.5Western blot法考察心臟移植物凋亡相關蛋白表達 取部分小鼠心肌組織在液氮中充分碾磨成粉狀后，加入到NP-40裂解液中超聲裂解，在4 ℃12 000×g下離心10 min，取上清液即為提取的心臟組織蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉膜2 h，5%牛奶室溫封閉2 h，加入二抗室溫下孵育1.5 h，滴加顯影底物，顯影和掃描膠片。

1.6ELISA法檢查血清炎性相關因子表達 取外周血離心后收集血清，用ELISA試劑盒檢測小鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達。

1.7統計學處理方法 采用SPSS17.0統計軟件進行數據分析。數據以±s表示，2組均數比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.12組小鼠移植心臟的HE染色結果比較 單純心臟移植組心肌組織結構紊亂，可以看到大量炎癥細胞浸潤，并伴有大量心肌細胞壞死，而心臟移植+ VGX-1027治療組心肌組織中結構也有紊亂，但較單純心臟移植組輕，且心肌細胞壞死得到顯著改善，炎癥細胞浸潤明顯降低，見圖1。

圖1　移植心臟組織HE染色（×400）

2.22組小鼠移植心臟的T淋巴細胞浸潤比較 心臟移植+VGX-1027治療組小鼠CD3+T細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞的浸潤情況明顯少于單純心臟移植組，見圖2。計數陽性細胞后顯示，心臟移植+VGX-1027治療組小鼠CD3+T細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞的浸潤數量明顯少于單純心臟移植組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖2　移植心臟組織免疫組織化學染色（×400）

2.32組小鼠移植心臟的凋亡相關蛋白表達比較

Western blot法檢測結果顯示，與單純心臟移植組相比，心臟移植+VGX-1027治療組小鼠心肌組織中的凋亡蛋白caspase-3和Bax的表達量顯著減少，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量顯著增加，見圖4。

2.42組小鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達比較 ELISA法檢測結果顯示，VGX-1027治療組小鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度較單純心臟移植組顯著降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖5。

圖3　移植心臟組織中細胞浸潤水平分析結果

圖4　移植心臟組織中caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平

圖5　小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達

3　討論

心臟移植物缺血再灌注損傷本質上是一種多因素參與的炎癥性損傷[11-12]，雖然具體的作用機制和信號通路尚未得到完整的解釋，但在已有的發現中，TLR4介導的信號通路在其中扮演了非常重要的角色，激活TLR4可使MAPK磷酸化，隨后激活NF-κB和AP1，最終影響T淋巴細胞的增殖活化及炎癥介質的表達，主要表現為T淋巴細胞活化、促炎因子的表達增加和抗炎因子的表達減少，從而引起心臟移植物功能不全或移植失敗[5]。VGX-1027是一種具有免疫調節作用的小分子化合物，可通過拮抗TLR4[6-7]，在各種急性及慢性免疫炎癥性疾病中發揮保護作用，這已經在多種動物模型中得到了證實[6]。

在本研究中，VGX-1027明顯抑制移植心臟組織中的CD3+T細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞浸潤，減少全身炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達，對移植心臟缺血再灌注損傷起保護作用。另外，VGX-1027可使移植心臟促凋亡蛋白caspase-3和Bax的表達降低以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達升高。本研究證實了VGX-1027可以通過抑制相關炎癥因子的釋放和抗凋亡作用，來減輕心臟移植物缺血再灌注損傷。

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（本文編輯：吳昔昔）

·論著·

The protection of VGX-1027 on myocardial ischemia-reperfusion injury in mice cardiac transplantation

DAI Juji1,ZHENG Xiangtao1,FU Hongxing2,ZHOU Mengtao1.1.Department of General Surgery,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 2.School of Pharmacy,Wenzhou Medical University,Wenzhou,325035

Abstract:Objective:To explore the effect of VGX-1027 on myocardial ischemia-reperfusion (MI/R) injury in mice cardiac transplantation.Methods:Forty mice were randomly divided into 2 groups:cardiac transplantation group and cardiac transplantation+VGX-1027 group (70 mg/kg).The grafts were collected at 24 h after cardiac transplantation.Histopathology was observed with haematoxylin-eosin staining.CD3+T cell,CD4+T cell and CD8+T cell infiltrated into cardiac grafts were detected by immunohistochemistry.Expression of caspase-3,Bax and Bcl-2 were determined with Western blotting,and cytokines expression of TNF-α,IL-1β and IL-6 were measured with ELISA.Results:Compared with cardiac transplantation group,mice treated with VGX-1027 exhibited significantly lower degree of leukocyte and myocyte necrosis.The infiltration of CD3+T cell,CD4+T cell and CD8+T cell in grafts were reduced with the treatmet of VGX-1027.The expression of caspase-3 and Bax was inhibited in cardiac transplantation+VGX-1027 group while the expression of Bcl-2 was increased.Furthermore,VGX-1027 pretreatment resulted in a decrease in serum cytokines of TNF-α,IL-1β and IL-6.Conclusion:VGX-1027 can significantly reduce ischemia-reperfusion injury in mice cervical cardiac transplantation model.

Key words:heart transplantation; ischemia-reperfusion injury; VGX-1027; C57BL/6 mice

通信作者：周蒙滔，主任醫師，教授，博士生導師，Email：zmt 0417@hotmail.com。

作者簡介：戴駒驥（1990-），男，浙江瑞安人，碩士生。

基金項目：溫州市科技局科技計劃項目(Y20140147）。

收稿日期：2015-08-16

[中圖分類號]R654.2

[文獻標志碼]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.03.006