復方黑骨藤抗類風濕關節炎作用及機制的研究

侯玉婷,　黎　霞,　張　宏,　王菡鈺,　張曉凰,　湯義珍

(四川師范大學 生命科學學院, 四川 成都 610101)

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復方黑骨藤抗類風濕關節炎作用及機制的研究

侯玉婷,黎霞,張宏*,王菡鈺,張曉凰,湯義珍

(四川師范大學 生命科學學院, 四川 成都 610101)

摘要：目的：研究復方黑骨藤對類風濕關節炎(RA)的治療作用及其作用的分子機制.方法：將實驗大鼠分組并建立佐劑性關節炎(AA)動物模型，觀察復方黑骨藤低、中、高劑量對AA大鼠足腫脹、體重、器官指數及血清白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量水平的影響.結果：復方黑骨藤能有效抑制AA大鼠足腫脹，降低胸腺指數，下調AA大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量水平.結論：復方黑骨藤具有良好的抗RA作用，其作用機制可能與調節免疫器官功能及減少IL-1、IL-6、TNF-α的產生，從而達到抗炎消腫和阻止關節軟骨破壞的作用有關.

關鍵詞：復方黑骨藤; 類風濕關節炎; 白細胞介素-1β; 腫瘤壞死因子-α; 白細胞介素-6

類風濕關節炎(RA)是以關節滑膜為靶器官的影響活動關節的自身免疫性疾病，其主要病理基礎為滑膜炎癥[1]，主要表現為免疫調節失衡、關節組織慢性炎癥病變.其發病機制涉及抗原、免疫細胞、細胞因子等多種因素參與的一系列免疫反應[2-3]，入侵的抗原被滑膜細胞吞噬、加工、處理后，將抗原信息傳遞給并激活T淋巴細胞，使之釋放出多種細胞因子、生長因子及各種遞質，最終導致了滑膜炎及血管翳的生成，進而出現關節畸形及功能喪失[4].黑骨藤具有祛風除濕、舒筋活血、止痛等功效，主治風濕麻木疼痛，跌打損傷、骨折、骨痛等[5]，藥理研究表明它在治療風濕與類風濕性關節炎等疾病方面有明顯的療效[6]，且作用明顯，毒副作用小.復方黑骨藤是以黑骨藤為主藥，配以秦艽、元胡兩味中藥經乙醇超聲提取后所得.

1材料

1.1實驗動物SPF級SD大鼠，雄性，體質量(180±10) g.由四川省實驗動物專委會養殖場提供，生產許可證為SCXK(川)2013-24.

1.2藥材與藥品黑骨藤PeriplocaforrestiiSchltr. 藥材購買于西昌藥材市場，經成都中醫藥大學張藝鑒定；秦艽(GentianamacrophyllaPall.,批號：20130526)及元胡(Rhizomacorydalis，批號：20130605)均購買與北京同仁堂股份有限公司.醋酸潑尼松片(批號：國字準藥：H33021207，規格5 mg/片，浙江仙琚制藥股份有限公司生產)；雷公藤多苷片(批號：國藥準字Z31020415，規格10 mg/片，上海復旦復華藥業有限公司生產)；復方黑骨藤(高、中、低劑量組)由本實驗室自制.

1.3試劑與儀器弗氏完全佐劑Freund’ scomplete adjuvant,FCA，sigma公司生產)，IL-1β、IL-6、TNF-α定量ELISA試劑盒(均由上海邦奕公司生產，批號分別為DRE20113，DRE20064，DRE20040).全波長紫外分光光度計(Mss，成都軍能海爾思科技有限公司)，離心機(Anke TGL-16G，上海安亭科學儀器廠)，動物天平(ESJ120-3，沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司)，PV-200足腫脹測定儀(TW025-0812，成都泰盟科技發展有限公司生產).

2方法

2.1動物分組及造模取SD健康雄性大鼠70只，鼠齡3月，適應性飼養1周后，實驗前將動物隨機分為空白對照組、模型組、醋酸潑尼松組、雷公藤多苷片組、復方黑骨藤(高、中、低劑量)組共7組，每組各10只.實驗當天，參照文獻[7]的佐劑性關節炎造模方法，除空白組外，每只大鼠右后足趾皮下注射0.1 mL弗氏完全佐劑致炎，空白組注射等量0.9%氯化鈉溶液.大鼠注射弗氏完全佐劑6 h后，足腫脹開始持續增加，膝關節變大，說明造模成功.

2.2給藥致炎24 h后，分別給實驗鼠灌胃相應的藥液，空白組和模型組每天灌胃質量分數5‰ CMC-Na溶液；陽性組分別灌胃醋酸潑尼松29.2 mg·kg-1·BW、雷公藤多苷37.5 mg·kg-1·BW；復方黑骨藤高、中、低劑量組分別灌胃劑量67、44、22 mg，每天每只大鼠灌胃1次，2 mL/只.連續灌胃21 d.

2.3大鼠足腫脹的測定用PV-200足腫脹測定儀分別于造模后第18小時、2、4、7、11、14、21天測量各組大鼠左、右足足跖容積，計算出足腫脹容積差值(足腫脹容積差=右足足拓容積-左足足拓容積).

2.4大鼠體重的測定于致炎前和致炎后第2、8、15、21天稱量大鼠體重，統計各組大鼠體重變化.

2.6血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量測定持續給藥21 d后將大鼠處死，心臟取血，檢測血液中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量.測定方法為：血液以3 000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA方法分別測得血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量.

3結果

3.1藥物對AA大鼠足腫脹的影響造模后，模型組從第1天起持續腫脹至第4天，而后開始逐漸消退；第11天后腫脹繼續發生，與空白組對照有極顯著差異(P<0.01).陽性組、復方黑骨藤組與模型組比較差異顯著(P<0.05)；雷公藤多苷組、復方黑骨藤高、中、低劑量組均能明顯減輕AA大鼠膝關節炎癥，使腫脹度明顯下降(P<0.05)；醋酸潑尼松組對AA大鼠膝關節炎癥的改善極明顯，使腫脹度能夠顯著下降(P<0.01).

表 1　復方黑骨藤對SD大鼠膝關節病變的影響+s)

注:與模型組對比1:P<0.05；與模型組對比2:P<0.01；與空白組對比3:P<0.01.

3.2藥物對AA大鼠體重的影響從表2可知，模型對照組、醋酸潑尼松組于注射佐劑后第8天與空白組大鼠體重對照，差異極顯著(P<0.01)，注射佐劑后大鼠的體重發生了變化，先正常生長，后體重開始增長緩慢.雷公藤多苷組、復方黑骨藤組與模型組大鼠體重比較，于21 d后出現顯著性差異，且各組大鼠的活動，進食正常，體重增加，且較空白組沒有顯著性差異.

3.3藥物對AA大鼠個臟器指數的影響從表3可知，醋酸潑尼松對胸腺、脾臟有顯著抑制作用，較模型組差異極顯著(P<0.01)，胸腺、脾臟出現了萎縮；復方黑骨藤高、中劑量組也能夠降低胸腺指

表 2　復方黑骨藤對AA大鼠體重的影響

注:與模型組對比1:P<0.05；與模型組對比2:P<0.01；與空白組對比3:P<0.01.

表 3　復方黑骨藤對AA大鼠各臟器指數的影響+s,n=10)

注:與模型組對比1:P<0.05；與模型組對比2:P<0.01；與空白組對比3:P<0.01.

表 4　復方黑骨藤對AA大鼠血漿中IL-1β、IL-6、 TNF-α含量的影響

注:與模型組對比1:P<0.05；與模型組對比2:P<0.01；與空白組對比3:P<0.01.

數，與模型組比較有顯著差異(P<0.05)，但不及醋酸潑尼松組.雷公藤多苷片和復方黑骨藤組的腎臟、脾臟、指數較空白組的高；醋酸潑尼松組、雷公藤多苷組、劑量復方黑骨藤組的肝臟指數較模型組的高.

3.4藥物對AA大鼠血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α含量的影響從表4可見，醋酸潑尼松降低了AA大鼠血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量水平，與模型組比較差異極顯著(P<0.01)；雷公藤多苷片組、低、中、高劑量復方黑骨藤組與模型組比較也有顯著性差異(P<0.05)，表明雷公藤與復方黑骨藤均有不同程度的降低血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量水平.低劑量復方黑骨藤組與雷公藤多苷組之間的差異不顯著.

4討論

RA是一種嚴重影響人類健康的以關節滑膜炎癥病變為主要特點的全身性、慢性、自身免疫性疾病，胸腺、脾臟等指數的變化也是反映動物機體免疫功能的最基本和最常規的指標之一.作為初步觀察藥物對免疫功能影響的指標，本試驗目前研究結果表明，復方黑骨藤能顯著降低胸腺指數，提高腎臟、肝臟、脾臟指數，提示黑骨藤可能通過調節免疫器官功能來提高抗類風濕關節炎作用的能力，其與雷公藤多苷沒有顯著性差異，但不及醋酸潑尼松.醋酸潑尼松對AA大鼠的體重增長有較大的影響，并使其胸腺極度萎縮，表現出較強的免疫抑制作用.

國內外研究發現RA的發生發展與細胞因子有密切關系，RA發生機制是由于患者體內細胞因子網絡自身調節系統被破壞，細胞因子異常產生及功能紊亂所引起[8].在細胞因子網絡中以白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)為代表的致炎性細胞因子研究的比較多，它們在觸發滑膜細胞激活導致關節受損和誘導炎癥過程中起著重要作用[9].IL-1β和TNF-α主要由單核細胞及巨噬細胞產生[10]，二者相互協調、促進，它們的效應及靶細胞的范圍有很大的相似性，均是RA致病機理中具中心地位的促炎癥細胞因子，參與RA發生發展的全過程.IL-1β、TNF-α均可通過刺激滑膜組織滑膜細胞核軟骨細胞中IL-6、前列腺素E2、膠原酶和基質金屬蛋白酶的合成釋放，引起RA患者免疫功能紊亂，局部炎癥反應加劇，骨與軟骨基質不可逆破壞，以及血管翳形成[9,11]；同時使破骨細胞減少糖蛋白合成，增加糖蛋白降解，并產生膠原酶和其他中性蛋白酶，釋放骨鈣等，從而導致骨和軟骨破壞[12].大量研究表明TNF-α和IL-1β在滑膜炎癥中高度表達，通過抗腫瘤壞死因子α和白細胞介素β的治療，減少TNF-α和IL-1β表達，對治療類風濕關節炎有確切的療效[4,13].IL-6是一種促炎癥細胞因子，能增強IL-1和TNF-α的效應，被認為是TNF-α的某些生物效應的放大因子[14].IL-6能夠促進B細胞增殖，并分化為免疫球蛋白分泌細胞，促進肝臟合成急性相關蛋白和促進類風濕因子的合成[15].此外IL-6可以通過提高骨細胞和滑膜細胞中細胞核因子κβ活化因子配體的釋放，促進破骨細胞生成因子表達[16].而且研究也表明RA患者血清及滑膜液中IL-6及IL-6R濃度升高，IL-6的水平和疾病活動性及臨床表現有密切關系[17].本研究發現模型組AA大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6含量均顯著高于空白組大鼠(均P<0.01)，證明細胞因子網絡失衡在類風濕關節炎的病程發展中發揮重要作用.AA大鼠經過治療后，細胞因子水平明顯降低，其中醋酸潑尼松和高劑量復方黑骨藤下降最為明顯(P<0.01)，雷公藤多苷和低、中劑量復方黑骨藤組下降比較明顯(P<0.01，P<0.05)，表明醋酸潑尼松、雷公藤多苷、復方黑骨藤均可降低細胞因子水平，且中劑量復方黑骨藤較雷公藤多苷片效果更加明顯.說明復方黑骨藤能減少IL-1β、IL-6及TNF-α的產生，從而達到抗炎及阻止軟骨破壞的作用來發揮抗RA的作用.這可能是復方黑骨藤方治療RA的途徑之一，這與其他研究成果相似[18-24].

該研究為復方黑骨藤用于治療類風濕關節炎等自身免疫性疾病的分子機制提供了實驗依據，同時更進一步地驗證了在關節抗炎和免疫抑制及阻止軟骨破壞的作用方面，顯示了復方黑骨藤具有較大的開發和應用前景.

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(編輯周俊)

Effects and Mechanism ofPeriplocaforrestiiSchltr.Compound Against Rheumatoid Arthritis

HOU Yuting,WANG Hanyu,LI Xia,ZHANG Hong,ZHANG Xiaohuang,TANG Yizhen

(SchoolofLifeSciences,SichuanNormalUniversity,Chengdu610101,Sichuan)

Abstract：To achieve the anti-arthritic effects and the possible molecular mechanism against rheumatoid arthritis (RA), the Periploca forrestii Schltr. Compounds were studied by observing the changes of paw swelling, body weight, viscera index and levels of interleukin 1β(IL-1β), interleukin 6(IL-6)and tumor necrosis factor α(TNF-α) after medication with establishing Freund’s adjurant arthritis (AA) rat model. It shows that Periploca forrestii Schltr. compound effectively inhibits articular swelling, decreases thymus index and regulates down the content of IL-1β, IL-6 and TNF-α in the serum of AA rats by reducing the production of IL-1β, IL-6 and TNF-α as well as inhibiting joint damage.

Key words：Periploca forrestii Schltr compound; rheumatoid arthritis; interleukin-1β; tumor necrosis factor-α; interleukin-6

doi:10.3969/j.issn.1001-8395.2016.01.022

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1001-8395(2016)01-0123-05

*通信作者簡介：張宏(1965—)，女，教授，主要從事天然產物化學的研究,E-mail:401923129@qq.com

基金項目：國家自然科學基金(31240087)

收稿日期:2015-03-25