兩種鐵角蕨的孢子體形態研究及水分生理測定

李學梅,楊 揚,徐成東

(1.云南大學生命科學院,昆明650091；2.楚雄師范學院化學與生命科學系,云南楚雄675000；3.云南農業大學植物保護學院,昆明650201；4.云南省高校應用生物學重點實驗室,云南楚雄675000)

兩種鐵角蕨的孢子體形態研究及水分生理測定

李學梅1,2,楊 揚3,徐成東2,4?

(1.云南大學生命科學院,昆明650091；2.楚雄師范學院化學與生命科學系,云南楚雄675000；3.云南農業大學植物保護學院,昆明650201；4.云南省高校應用生物學重點實驗室,云南楚雄675000)

以鐵角蕨屬(Asplenium)兩種不同植物的孢子體為材料(石生鐵角蕨和變異鐵角蕨),通過常規形態解剖方法和水分生理指標測定,分析探討了這兩種植物的形態特征與水分生理特點之間的適應性。結果表明: (1)石生鐵角蕨和變異鐵角蕨相比較,石生鐵角蕨葉面積指數較大,葉片更為飽滿。(2)兩種鐵角蕨表皮細胞的垂周壁均為不規則形,分別呈現出深波狀或淺波狀。(3)兩種鐵角蕨的氣孔器全為下生氣孔,且氣孔器類型、形狀、氣孔大小及長寬比都很穩定。但是,二者之間氣孔密度有很大差異,而氣孔器類型以不規則四細胞型、腋下細胞型和極細胞型為主。(4)木質部維管束均為橢圓形的雙柱型管狀中柱,中柱內含有管狀分子,呈背對月牙形分布,中柱大小約為80 μm。(5)維管束內的管狀分子次生壁出現不同程度的木質化增厚,以網紋、梯紋、孔紋的形式表現出來,管狀分子的直徑都較小,變異鐵角蕨的木質部管狀分子比石生鐵角蕨的稍大。(6)石生鐵角蕨的自然含水量較低,相對含水量較自然含水量變化較小,束縛水與自由水比值和水勢較高。從石生鐵角蕨和變異鐵角蕨的葉表皮形態、氣孔器特征、管狀中柱和管狀分子特征來看,將二者劃分在同一屬下是比較合理的。兩種植物自然生境不同,其水分生理特征差異明顯,但均與各自的形態特征相適應；石生鐵角蕨的抗旱性比變異鐵角蕨更強。該研究結果可為鐵角蕨屬植物的系統分類和抗旱性研究提供更多的資料。

鐵角蕨,表皮細胞,氣孔器,管狀分子,相對含水量,水勢

鐵角蕨屬(Asplenium)植物隸屬于鐵角蕨科(Aspleniaceae),該屬是鐵角蕨科中種類最多、形態變化最大的1個屬(吳兆洪和秦仁昌,1991)。鐵角蕨屬在中國約有110種,分布于全國各地,以熱帶和亞熱帶為分布中心(中國植物志,1999)。鐵角蕨屬不像同科的其它屬一樣具有十分穩定的染色體基數,多倍體現象十分普遍,屬間和種間雜交廣泛存在,形態變異非常大。所有的這一切都使得該屬的系統分類存在很大的困難。近年來,國內學者關于鐵角蕨科植物的研究主要有戴錫玲等(2005)利用掃描電鏡對國產鐵角蕨科(Aspleniaceae)8屬59種植物的孢子形態進行觀察,從孢粉學的角度對該科的分類和系統演化進行了探討；候鑫和王中仁(2000)對中國產鐵角蕨(A.trichomanes)進行了種下分類研究；李春香和陸樹剛(2006)利用葉綠體rbcL、trnL-F和rps4-trnS序列的證據從分子系統學方面證明云南鐵角蕨與瀘山鐵角蕨是一對親緣關系非常近的物種；檀龍顏和劉保東(2007)用光學顯微鏡觀察和比較了4種鐵角蕨植物的配子體的發育過程從而進行系統分類；鄧晰朝等(2006)、王任翔和陸樹剛(2010)等對鐵角蕨屬植物葉表皮微形態和孢子形態進行觀察,以期達到對該屬植物進行系統分類的目的。蕨類植物的表皮及附屬組織特征是分類的重要依據之一。本文通過對兩種鐵角蕨屬植物石生鐵角蕨(A.saxicola),變異鐵角蕨(A.varians)的孢子體形態進行解剖研究,不僅是從葉表皮微形態方面,還從葉柄橫切、維管束形態、葉面積、葉片厚度等方面進行比較分析,判斷二者之間的相似程度,同時為鐵角蕨屬植物的系統分類提供依據。

水分是植物進行正常生理活動的決定性因子之一,水分對植物的重要性體現在水分是植物體的組成部分；參與植物體內的新陳代謝；在植物對環境的適應中起著重要作用。植物組織的總含水量是反映組織水分狀況的基本指標。植物體內的水分可分為自由水與束縛水兩種類型,束縛水的數量是細胞膠體親水程度的指標之一,由于它比自由水更加難以被蒸騰出去,因而他們對干旱的抗性較大(陳建勛和王曉峰,2002；潘瑞熾等,2012)。束縛水/自由水比值的高低與植物的生長快慢呈正比,與植物的抗性呈反比(王康英,2011)。然而,在前人的研究中,對鐵角蕨科植物的水分生理測定幾乎還是一片空白。本文通過測定兩種鐵角蕨的含水量、自由水與束縛水的比值、水勢等指標,來探討鐵角蕨屬植物的形態學特征與水分代謝之間的關系,以期為后期鐵角蕨科植物的抗旱性研究積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

石生鐵角蕨(A.saxicola)和變異鐵角蕨(A.vari-ans)的野生植株均采自哀牢山國家級自然保護區(海拔:3 166 m),之后栽培于楚雄師范學院生物溫室中。

1.2 實驗方法

1.2.1 葉片表皮細胞及氣孔器的觀察 張秀芳等(2002)采用印跡觀察法。取兩種鐵角蕨植物葉片的中部羽片,刮去其上孢子囊群及附屬物,用蒸餾水沖洗干凈并自然晾干,將透明指甲油均勻涂刷于羽片上、下表皮,待油膜自然晾干后用鑷子輕輕撕下,將葉片表皮油膜模型分別平鋪于滴有甘油的載玻片制成臨時裝片,然后轉移到Olympus BX63型光學顯微鏡觀察、拍照。

1.2.2 葉柄橫切觀察 采用常規形態解剖學研究方法,用雙面刀片做徒手切片,解剖針或毛筆挑選薄而完整的切片置于載玻片上用1 番紅試劑染色5 min左右,用濾紙吸取多余的染液,用滴管吸取1滴蒸餾水滴于材料處蓋上蓋玻片制成臨時裝片,然后轉移到Olympus BX63型光學顯微鏡觀察、拍照。

1.2.3葉柄木質部管狀分子的制取和觀察 將采集到的新鮮蕨類洗凈后,取葉柄和根狀莖,剝離維管束并剪成0.5～1.0 cm的小段,浸泡于FAA固定液(福爾馬林∶冰醋酸∶70 酒精溶液＝90∶5∶5)中保存備用。將材料從固定液中取出并清洗后,浸于Jeffrey離析液(10 鉻酸∶10 硝酸＝1∶1)中在室溫下離析。將離析好的材料先用蒸餾水漂洗,隨后采用乙醇溶液梯度(50 、60 、70 、80 、90 )脫水。制做臨時裝片,轉移到Olympus BX63型光學顯微鏡觀察、拍照。

1.2.4 植物組織含水量和相對含水量的測定 植物組織含水量測定采用烘干法,組織相對含水量采用水分飽和法。鮮重測定:剪取植物材料,裝入已知重量和風干過的信封中用電子天平稱取鮮重(Fresh weight,Wf)。飽和鮮重測定:將稱過鮮重的植物材料浸入水中,數小時后取出,用吸水紙吸干表面水分,立即稱重。重復數次,直到兩次稱重的結果基本一致不再變化,記錄此時的讀數即為飽和鮮重(Sat-urated fresh weight,Wsf)。干重測定:將稱過飽和鮮重的植物材料裝入信封中,放入烘箱內,105℃殺青10 min,然后把烘箱的溫度降到70～80℃左右,烘至組織恒重。取出信封和材料,放入干燥器中冷卻至室溫,稱量得到干重(Dry weight,Wd)。

取得以上數據后,按式1-1計算組織含水量(Tissue water content,W)和式1-2計算組織相對含水量(Relative water content,RWC)。

1.2.5 植物水勢的測定 采用阿貝折射儀法(潘瑞熾等,2012)。配制一系列不同濃度的蔗糖溶液(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mol/L)各5 mL,注入8支編好號的試管中,用折射儀分別測定1～8管的折光系數。用直徑5 mm的打孔器在葉片中部靠近主脈附近打取葉圓片,隨機取樣,浸入1～8號試管中,每管放入相等數目的葉圓片,加塞,放置1 h,其間搖動數次。然后用折射儀再次測定蔗糖溶液的折光系數。前后兩次測定其折光系數不變或者變化很小的試管中的糖濃度即為等滲濃度或近等滲濃度。葉片的水勢與此種濃度溶液的滲透勢相等。

精準扶貧重在“扶”與“貧”，“扶”是“供給”方，“貧”是“需求”方。“供給”體現在通過供給側改革調整和改善扶貧資源要素供給結構，提高供給質量和效率，指導精準扶貧工作，從而促進貧困對象真脫貧和脫真貧。供給側改革旨在調整供給結構，最優配置勞力、土地、資本、制度等資源要素，提高經濟發展質量，影響長期經濟發展。需求側改革重點集中包括投資、消費、出口在內的三駕馬車，影響短期經濟發展。“供給側”和“需求側”構成對應關系，我們研究重點是“供給側”，供給側改革集中在生產要素(含勞力、土地、資本、制度)等主線上推進，見圖3。

按式1-3計算葉片細胞的水勢。式中,Ψcell為植物細胞水勢；Ψout為外界溶液滲透勢；i為解離系數,蔗糖溶液為1；c為小液滴在其中基本不動的溶液濃度,單位是mol/L；R為摩爾氣體常數,R＝0.083× 105(L?Pa)/(mol?K)；T為熱力學溫度,單位是K,即273＋t,t為實驗溫度,單位是℃。

1.2.6 植物體內自由水與束縛水含量測定 采用阿貝折射儀法(潘瑞熾等,2012)。取生長狀況、生長部位、葉齡等較為一致的健康完整葉片5～10片,用直徑5 mm鉆孔器在葉片中部靠近主脈附近打取葉圓片。先用移液管吸取60 蔗糖溶液5 mL,加到稱量瓶中稱重得所加蔗糖溶液的重量mB,并用阿貝折射儀測得蔗糖溶液的含糖百分數B1。接著將葉圓片稱取鮮重Mf,放入已稱重的蔗糖溶液中。小心搖動瓶中溶液,使與樣品混合均勻,放在陰涼處4～5 h,期間經常搖動。隨后用阿貝折射儀測定浸出液的含糖百分數B2。按式1-4計算植物樣品中自由水含量。式中:β為自由水含量( )；mB為加入樣品中蔗糖溶液的質量；B1為蔗糖溶液的質量分數；B2為加樣后糖溶液的質量分數；Mf為植物樣品鮮重。

圖版Ⅰ 兩種鐵角蕨植物葉上下表皮特征(表面觀) 1,2.石生鐵角蕨；3,4.變異鐵角蕨；1,3.上表皮；2,4.下表皮。Plate I Characters of upper and lower epidermis of two species of Asplenium(surface view) 1,2.A.saxicola；3,4.A.varians；1,3.Upper epidermis；2,4.Lower epidermis.

表1 2種鐵角蕨屬植物葉表皮特征Table 1 Epidermis characteristics of two species of Asplenium

求得自由水含量后,束縛水含量＝組織含水量－自由水含量。

1.2.7 方格紙法測定葉面積 本研究采用方格紙法。將葉片摘取后,平鋪于由1 mm2小方格組成的方格紙上,用鉛筆描出葉片的形狀,然后統計葉片所占的方格數,再乘以每個方格的面積即得到葉片面積。對于處在葉片邊緣的不完整方格按實際情況進行取舍,常用的比例為1/2或者1/3,當葉片所占面積大于此值時算一個方格,相反則忽略不計。

1.2.8 游標卡尺法測定植物葉片厚度 隨機選取植物葉片10片,疊加在一起,用游標卡尺從不同的角度測定10片葉子的厚度并計數,然后根據平均值計算每一片葉片的厚度。

2 結果與分析

2.1 葉表皮特征和氣孔類型

在所觀察的鐵角蕨屬兩種植物材料中,氣孔器全為下生氣孔,即均分布在葉片的下表皮,上表皮無氣孔器。氣孔類型(Dilcher,1974；Fryns-Claessens＆Van Cotthem,1973)概括起來可分為極細胞型、腋下細胞型、聚腋下細胞型和無規則四細胞型幾種,上下表皮細胞的垂周壁呈淺波狀、深波狀、凹凸狀。

從圖版I和表1看出,石生鐵角蕨上、下表皮細胞為不規則形,垂周壁呈淺波狀或凹凸狀,細胞多為長條形(圖版I:1)；氣孔器類型多為腋下細胞型,少部分氣孔器為聚腋下細胞型和極細胞型(圖版I:2)。

變異鐵角蕨上表皮細胞為不規則形,垂周壁呈深波狀或無規則凹凸狀(圖版I:3),下表皮細胞垂周壁也為不規則的深波狀；氣孔器類型多為無規則四細胞型,少為極細胞型和不等細胞型(圖版I:4)。

表2 2種鐵角蕨屬植物氣孔器類型Table 2 Types of stomatal apparatus of two species of Asplenium

圖版Ⅱ 兩種鐵角蕨植物葉柄橫切特征 1,2.石生鐵角蕨；3,4.變異鐵角蕨；1,3.10×10；2,4.10×40。PlateⅡ Characters of leaves stalk cross section of two species of Asplenium 1,2.A.saxicola；3,4.A.varians；1,3.10×10；2,4.10×40.

圖版Ⅲ 兩種鐵角蕨植物管狀分子特征 1,2.石生鐵角蕨；3,4.變異鐵角蕨PlateⅢ Characters of vessel element of two species of Asplenium 1,2.A.saxicola；3,4.A.varians

2.2 葉柄橫切解剖學特征

通過對兩種鐵角蕨植物葉柄橫切面的觀察,發現兩種植物木質部均為雙柱型管狀中柱；在橫切面上呈現兩個近橢圓形的木質部中柱(圖版Ⅱ)。石生鐵角蕨葉柄橫切面取材為葉柄中上部,維管束木質部類型為兩個近橢圓形的管狀中柱,中柱里面具有大量的管狀分子,形似兩個背對的月牙(圖版Ⅱ: 1,2)。變異鐵角蕨葉柄橫切面取材也為葉柄中上部,維管束木質部類型也為兩個近橢圓形的管狀中柱,中柱里面具有由大量管狀分子組成的一對背對月牙形結構(圖版Ⅱ:3,4)。

2.3 葉柄木質部管狀分子特征

通過對兩種植物葉柄木質部的解剖觀察,發現兩種植物木質部均有管狀分子的存在,管狀分子的次生壁具有不同程度的木質化增厚,在壁上呈現出螺紋、環紋、梯紋、孔紋狀的木質化增厚形式(圖版Ⅲ)。石生鐵角蕨(A.saxicola)葉柄中的管狀分子次生壁上主要呈現出環紋和孔紋,管狀分子大小約為10 μm(圖版Ⅲ:1,2)。變異鐵角蕨(A.varians)葉柄中亦有管狀分子。管狀分子大小約為12 μm,管狀分子的次生壁增厚形式主要是以螺紋和梯紋的形式體現(圖版Ⅲ:3,4)。

2.4 葉面積及葉片厚度的測量

從表3可知,實驗所測兩種鐵角蕨葉片面積為復葉中的一小片,兩種植物的葉片均為小型葉,從葉面積特征來看,屬于典型的矮小的草本植物；兩種植物的葉面積和葉片厚度相差較大,表明兩種植物屬于不同生長環境。石生鐵角蕨葉面積約為214 mm2,葉面積指數較大,從葉面積指數來看,是較為飽滿的葉片。葉片厚度約為0.3 mm。變異鐵角蕨葉面積約為53 mm2,葉面積指數稍小,飽滿度適中,葉片厚度約為0.17 mm。

表3 2種鐵角蕨屬植物葉面積和葉片厚度Table 3 Leaf area and leaf thickness of two species of Asplenium

2.5 葉片的水分生理

從表4可知,石生鐵角蕨和變異鐵角蕨的自然含水量分別為65.05 、77.82 ,組織含水量分別為71.78 、89.42 ,束縛水與自由水的比值分別為1.34、1.16,水勢分別為－0.71 MP、－0.76 MP。

3 討論

兩種鐵角蕨葉片上下表皮細胞的垂周壁均為不規則的深波狀或淺波狀,這符合在同一屬中的植物葉表皮特征基本一致的觀點。

表4 2種鐵角蕨植物葉片水分情況分布Table 4 Water distribution of two species of Asplenium

兩種植物的氣孔器全為下生氣孔,即氣孔器均分布在葉片的下表皮。氣孔器的著生位置與許多類群的蕨類植物相似,如鳳尾蕨科(徐成東等,2012)、鱗毛蕨科(戴錫玲等,2012)、叉蕨科、風丫蕨科(戴錫玲等,2009)、水龍骨科(邵文等,2011)等。氣孔器類型概括起來可分為極細胞型、腋下細胞型、聚腋下細胞型、無規則細胞型、不等細胞型和無規則四細胞型,這幾種氣孔器中只有極細胞型和腋下細胞型為基本類型,其它類型均與基本類型很相似(無規則細胞型除外)。雖然,每一種蕨類植物均有一種主要的氣孔器類型,如石生鐵角蕨氣孔器類型多為腋下細胞型,少部分氣孔器為聚腋下細胞型和極細胞型；變異鐵角蕨氣孔器類型多為無規則四細胞型,少數為極細胞型和不等細胞型,但均印證了同一科中氣孔類型相似這一規律。氣孔器的長寬比較為穩定,特別是在同一個屬中的兩種植物中,長寬比差異不超過0.2。石生鐵角蕨的長寬比為1.21,變異鐵角蕨的長寬比為1.33,二者長寬比的差值為0.12。

從兩種植物葉柄橫切來看,兩種植物木質部均為雙柱型的橢圓形管狀中柱；中柱大小約為80 μm,中柱中維管束呈背對月牙形的維管束。維管束內存在明顯的管狀分子,次生壁出現不同程度的木質化增厚,以網紋、環紋、梯紋、孔紋的形式表現出來,管狀分子的直徑都較小,石生鐵角蕨的管狀分子大小約為10 μm,變異鐵角蕨的木質部管狀分子稍大,約為12 μm,這與自身水分代謝也存在一定關系。

綜上所述,依據兩種鐵角蕨的葉表皮細胞特征、氣孔器類型的長寬比、木質部的橫切面中上中柱的特征、管狀分子形態和大小共同說明了把石生鐵角蕨和變異鐵角蕨分在鐵角蕨科鐵角蕨屬鐵角蕨組是較為合理的。

從葉片面積、厚度,葉片水分生理測定結果來看,石生鐵角蕨葉面積約為214 mm2,葉面積指數較大,葉片厚度約為0.3 mm,是較為飽滿規則的葉片,也正符合本植物葉片無深裂的特征。變異鐵角蕨葉面積較小,約為53 mm2,葉面積指數稍小,葉片厚度約為0.17 mm,飽滿度適中,和本植物葉片有輕度裂痕相符合。

石生鐵角蕨的自然含水量較低,約為65 ,相對含水量較自然含水量變化較小,僅增加了6 左右,束縛水與自由水的比值約為1.34,水勢也稍高,約為－0.71 MPa。變異鐵角蕨自然含水量約為78 ,相對含水量較自然含水量變化較大,增加了11 左右,束縛水與自由水含量的比值約為1.16,水勢約為－0.76 MPa。

兩種植物氣孔均為橢圓形,其大小差異不大,但是密度差異明顯,石生鐵角蕨的氣孔密度明顯小于變異鐵角蕨。因為植物的氣孔密度和蒸騰大小有密切聯系,聯系前述水分生理指標來看,我們認為石生鐵角蕨的抗旱性強于變異鐵角蕨。

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Sporophytic morphology characteristics comparison and water physiological indexes measurement of two pteridophytes in Asplenium

LI Xue-Mei1,2,YANG Yang3,XU Cheng-Dong2,4?

(1.College of Life Sciences,Yunnan University,Kunming 650091,China；2.Department of Chemistry and Life Sciences,Chuxiong Normal
University,Chuxiong 675000,China；3.College of Plant Protection,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China；
4.Key Laboratory of Applied Biology of Colleges and Universities in Yunnan Province,Chuxiong 675000,China)

Taking two different sporophytes of Asplenium,Asplenium saxicola and A.varians as materials,we studied the morphological characteristics through conventional anatomical method,and water physiological indexes to compare the applicability of morphological characteristics and water physiological characteristics.The results were as follows: (1)The area of pinnule of A.saxicola was about 214 mm2and its thickness was about 0.30 mm,and the leaf area in-dex was about 0.74.The area of pinnule of A.varians was about 53 mm2and its thickness was about 0.17 mm,and the leaf area index was about 0.65.Leaf area index of A.saxicola was more larger than A.varians. (2)Their epidermal cells were irregular shape and anticlinal walls were repand or sinuate type. (3)The stomatal structure of two pterido-phytes in Asplenium were all swells,which indicated that all stomata distributed in the lower epidermis,not in the ad-axial epidermis.And stomatal type,shape,size and aspect ratio were stable,the average length mainly in the region of 30－36 μm,the average width of the distribution in 20－28 μm region,the aspect ratio of 1.21 in A.saxicola and the A.varians was 1.33,their aspect ratio of the difference of 0.12,not more than 0.2.But their stomatal type mainly in-clude polocytictype,coaxillocytictype,anomotetracytictype,and the stomata density were significantly different,72 Nun/mm2and 112 Nun/mm2. (4)Xylem vascular bundle were oval double column siphonostele,tracheary elements were back-to-back crescent-shaped,the siphonostele was about 80 μm. (5)The secondary wall of tubular molecules in the vascular bundle appeared different degrees of lignification thickening,both characteristic of tubular molecules,reticulate toroid and scalariform were observed,their diameters were small,the tubular molecules of A.varians was slightly larger than A.saxicola. (6)Relative water content of A.saxicola was about 65 ,and its natural moisture con-tent was smaller than the relative water content,only increased by about 6 ,ratio of bound water and free water was 1.34,and the water potential－0.71 MPa.Relative water content of A.varians was about 78 ,its natural moisture content larger than the relative water content,increased by about 11 ,ratio of bound water and free water was 1.16,and the water potential－0.76 MPa.And the drought resistance of A.saxicola was stronger than A.varians.The two fern plants were different in water physiological indexes,but adapted to their morphological characteristics.Therefore,it was relatively reasonable to classify A.saxicola and A.varians to be the same genus,based on the leaf epidermis mor-phology,stomatal characteristics,xylem vascular bundle and tubular molecules characteristics of view.The study would accumulate more information for Asplenium and drought studies.

Asplenium,epidermal cells,stomatal apparatus,tubular,relative water content,water potential

Q945,Q944

A

1000-3142(2016)02-0224-07

10.11931/guihaia.gxzw201312047

李學梅,楊揚,徐成東.兩種鐵角蕨的孢子體形態研究及水分生理測定[J].廣西植物,2016,36(2):224－230

LI XM,YANG Y,XU CD.Sporophytic morphology characteristics comparison and water physiological indexes measurement of two pteridophytes in Asplenium [J].Guihaia,2016,36(2):224－230

2015-03-15

2015-06-25

國家自然科學基金(31260095)；云南省高校應用生物學重點實驗室建設項目[Supported by the National Natural Science Foundation of China(31260095)；Project of Key Laboratory of Applied Biology of Colleges and Universities in Yunnan Province]。

李學梅(1989-),女,云南大姚人,碩士研究生,主要從事植物生理生態學研究,(E-mail)lxmzoe＠163.com。

?通訊作者:徐成東,博士,教授,主要從事植物學與植物生態學研究,(E-mail)chtown＠cxtc.edu.cn。