木欖胚軸中一個(gè)新生物堿及其抗乙肝病毒活性研究

陳志勇，曲彩紅，盧 靜，程 剛，高程海

（1.空軍大連通信士官學(xué)校，遼寧大連116600；2.廣西科學(xué)院廣西近海海洋科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530007）

( 1.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院天然藥物研究中心，昆明650032；2.云南中醫(yī)學(xué)院，昆明650500 )

木欖胚軸中一個(gè)新生物堿及其抗乙肝病毒活性研究

陳志勇1，曲彩紅1，盧 靜1，程 剛1，高程海2*

（1.空軍大連通信士官學(xué)校，遼寧大連116600；2.廣西科學(xué)院廣西近海海洋科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530007）

木欖為紅樹科木欖屬植物，其在廣西沿海地區(qū)有用作食物的傳統(tǒng)，同時(shí)有消炎、治瘧疾和清熱解毒等功效。該研究以采自廣西北侖河口國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的紅樹木欖（Bruguiera gymnorrhiza）胚軸為對(duì)象，應(yīng)用現(xiàn)代色譜方法（硅膠柱色譜、制備液相及制備薄層色譜等），從中分離獲得1個(gè)生物堿類單體化合物。運(yùn)用光譜分析技術(shù)(HRMS、1H NMR、13C NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC)鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)為新化合物，命名為Gymnorrhizin A。運(yùn)用MTT法，發(fā)現(xiàn)該化合物在對(duì)乙肝病毒表面抗原（HbsAg）和乙型肝炎e抗原（HbeAg）的50%抑制濃度（IC50）分別為4.37 mmol·L-1和4.89 mmol·L-1，治療指數(shù)（TI）分別為2.68和2.40。通過對(duì)紅樹木欖胚軸化學(xué)成分進(jìn)行深入研究，闡明其中抗乙肝病毒活性物質(zhì)基礎(chǔ)，為相關(guān)新藥研發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

天然產(chǎn)物研究，生物堿，乙肝病毒表面抗原，乙型肝炎e抗原，治療指數(shù)

木欖（Bruguiera gymnorrhiza）為紅樹科木欖屬植物，主要分布于非洲、東南亞、美洲加勒比海的海岸線沿岸，在中國主要分布于廣東、廣西、海南、福建和臺(tái)灣等地（高程海等，2011）。廣西沿海城市防城港、北海和欽州都分布有木欖，其在廣西沿海地區(qū)有用作食物的傳統(tǒng)，同時(shí)也有消炎、治瘧疾和清熱解毒的功效（邵長倫等，2009）。雖然對(duì)紅樹木欖根莖葉的化學(xué)成分已有研究，但文獻(xiàn)調(diào)查發(fā)現(xiàn)僅有對(duì)木欖屬植物B. parviflora的胚軸粗提物進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)（Bunyapraphatsara et al，2003）。

筆者之前報(bào)道了木欖胚軸含有苯丙素類化合物、醇苷類化合物（易湘茜等，2013，2015）。本文承接以上研究，繼續(xù)深入研究紅樹木欖中次生代謝產(chǎn)物，從中獲得1個(gè)新生物堿類化合物，并測試了其抗乙肝病毒活性，為相關(guān)新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 儀器與材料

Brucker Avance 600型核磁共振波譜儀（德國Bruker公司），Waters e2695 Alliance分析半制備高效液相色譜儀，N-1100V-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化株式會(huì)社），LCQDECAXP ESI質(zhì)譜儀（美國Finnigan公司），SIM-F140AY65型制冰機(jī)（日本Sanyo公司），CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（HERA，German），Olympus倒置相差顯微鏡（Japan CK-40-P200），MS3型振蕩器（德國IKA公司），IKA MS3 basic圓周振蕩器（廣州艾卡儀器設(shè)備有限公司）。

柱層析正相硅膠（200～300目，青島海洋化工廠），高效薄層色譜預(yù)制板（煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所），HepG2.2.15細(xì)胞株（上海研域生物科技有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物公司），1640培養(yǎng)液（gibco，USA），胰蛋白酶（北京索萊寶生物），拉米夫定（葛蘭素史克制藥有限公司）。

2011年6 月在廣西北侖河口紅樹林自然保護(hù)區(qū)采集研究樣品，經(jīng)王新助理研究員（廣西紅樹林研究中心）鑒別為紅樹科（Rhizophoraceae）木欖屬（Bruguiera）木欖（B. gymnorrhiza）的胚軸。木欖胚軸標(biāo)本保藏于廣西科學(xué)院廣西北部灣海洋研究中心（編號(hào)：2011-GXAS-018）。

1.2 提取與分離

將新鮮的木欖胚軸（濕重約12.0 kg）粉碎后使用有機(jī)溶劑（VCH2Cl2:VC2H5OH=1:2）在室溫下浸泡7 d，重復(fù)3次，每次獲得的浸出液經(jīng)減壓濃縮得總提取物（915 g）。分別用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等溶劑對(duì)總提取物萃取，減壓回收溶劑，依次得到氯仿萃取物（干重59.0 g）、乙酸乙酯萃取物（干重52.0 g）和正丁醇萃取物（干重171.0 g）和水相剩余物。

取適量硅膠粉至乙酸乙酯萃取物（52.0 g），充分?jǐn)嚢韪稍锖脱心ズ笱b入正相硅膠柱。依次用氯仿-丙酮洗脫系統(tǒng)（CHCl3:Me2CO=10:0-5:4/V:V）和氯仿-甲醇洗脫系統(tǒng)（CHCl3:MeOH=10:1-0:10/V:V）進(jìn)行梯度洗脫，流分經(jīng)薄層層析色譜檢測后合并為12個(gè)分離部位（Y1-Y12）。組份Y7用半制備型高效液相色譜HPLC分離純化，在梯度MeOH:H2O=5:95/V:V處，獲得化合物1（1.2 mg，t=19.02 min）。

1.3 化合物1的結(jié)構(gòu)鑒定

運(yùn)用1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HSQC、HMBC、1H-1H COSY、HRMS等分析方法，對(duì)分離得到的化合物1進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.4 化合物1抗乙肝病毒活性篩選測試

采用孫靜等（2014）的方法，用二甲基亞砜（DMSO）溶解化合物1為母液，臨用前用細(xì)胞培養(yǎng)液將母液依次稀釋成10、5、2.5、1.25、0.625 mmol·L-1等5個(gè)濃度梯度。陽性對(duì)照為拉米夫定，濃度0.1 mmol·L-1。

肝癌細(xì)胞HepG2.2.15復(fù)蘇后，再傳代，以每升1×107個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)2 d以等待細(xì)胞貼壁，然后加入上述所配不同濃度梯度的含藥培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)僅加正常培養(yǎng)液的陰性對(duì)照組和含1 mmol·L-1拉米夫定的陽性對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行樣，繼續(xù)培養(yǎng)6 d，分離上清液的低溫保存待用，剩余部分加5 g·L-1MTT 20 μL，在37℃孵育4 h，震蕩10 min，在吸收波長為490 nm處測試其吸光度值，計(jì)算得到細(xì)胞抑制率和TC50。用ELISA法對(duì)低溫保存的上清液中HbsAg和HbeAg進(jìn)行檢測，出現(xiàn)顯色反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取在A450 nm的吸收值。利用公式計(jì)算獲得抗原抑制率和半數(shù)有效濃度(IC50)。治療指數(shù)(TI)=TC50(半數(shù)毒性濃度)/IC50(半數(shù)有效濃度)。（其中TI≤1為毒性作用，1

2結(jié)構(gòu)鑒定和抗乙肝病毒活性測試

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為墨綠色晶體，易溶于甲醇。三氯化鐵溶液顯色為紫色。比旋光度（[α] 20 D）為–57.2°(c 0.54，MeOH)。IR譜顯示有羥基(3 428 cm-1)，酰胺基(1 667 cm-1)和芳香環(huán)(1 604 cm-1)等官能團(tuán)。HR-ESI-MS（m/z: 269.155 8 [M+H]+）提示分子量為268. 156 9，再結(jié)合1H NMR和13C NMR譜確定化合物1分子式為C14H23NO4，具有4個(gè)不飽和度。結(jié)合1H-NMR和13C-NMR譜，提示有3個(gè)不飽和度為三個(gè)碳碳雙鍵，因此，該化合物存在1個(gè)苯環(huán)。UV譜在lmax237和348 nm處有最大吸收。1H NMR譜在展示存在3個(gè)氧甲基dH3.82 (3H，s，3-OCH3)，3.82 (3H，s，5-OCH3)，3.73 (3H，s，4-OCH3)和2個(gè)氮甲基3.35（3H，s，NCH3），3.35（3H，s，NCH3），2個(gè)亞甲基2.78 (1H，dd，5.4，13.8，Hb-1?)，2.62(1H，dd，7.8，13.8，Hb-1?)，3.50 (2H，m，H-3?)，3個(gè)次甲基6.56 (1H，s，H-2)，6.56 (1H，s，H-6)，3.80(1H，m，H-2?)。13C NMR和DEPT譜表明了五個(gè)甲基dC49.9（N-CH3），49.9（N-CH3），56.5 (OCH3)，56.5 (OCH3)，61.1 (OCH3)，二個(gè)亞甲基(dC41.2，66.6)，三個(gè)次甲基(dC74.4，107.7，107.7)和四個(gè)季碳的存在(dC136.4，137.4，154.2，154.2)。

以上這些數(shù)據(jù)類似于化合物elemicin（Jayasinghe et al，2003）和3，4，5-trimethoxy-α- aminomethylbenzyl alcohol (Heacock & Hutzinger，1962)，以上信息提示該分子具有四取代的芳香環(huán)母核。

在HMBC譜中，從dH3.82 (3H，s，OCH3)到dC154.2 (C-3)，dH3.73 (3H，s，OCH3)到dC137.4 (C-4)，dH3.82 (3H，s，OCH3)到dC154.2 (C-5)之間的相關(guān)性表明了3個(gè)甲氧基分別與苯環(huán)上的C-3、C-4和C-5相連。從dH3.35 (2×NCH3)與dC66.6 (C-3?)相關(guān)表明，氮甲基結(jié)構(gòu)單元與C-3?相連。從1H-1H COSY可知，存在H-2?和Ha-1?/Hb-1?/H2-3?相關(guān)，表明存在-CH2-CH(OH)-CH2-結(jié)構(gòu)片段。從Ha-1?(2.78，dd，5.4，13.8)和Hb-1?(2.62，dd，7.8，13.8)與dC136.4 (C-1)相關(guān)表明，揭示結(jié)構(gòu)片段-CH2-CH(OH)-CH2-位于苯環(huán)骨架的C-1位置上。另外，2×NCH3和dC66.6（C-3?）確定2×NCH3接連在C-3?。基于以上數(shù)據(jù)，最終確定了化合物1的結(jié)構(gòu)（圖1）。化合物1的1H和13C NMR譜的數(shù)據(jù)歸屬通過HSQC和HMBC譜確定（見表1），命名為Gymnorrhizin A。

圖1化合物1的結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of Compound 1

圖2化合物1的關(guān)鍵HMBC和1H-1H COSY相關(guān)Fig. 2 Key HMBC correlation and1H-1H COSY of Compound 1

2.2 抗乙肝病毒活性測試

MTT法作為一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物因子的活性檢測、抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)及腫瘤放射敏感性測試。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用該方法觀察化合物1在具有抗HBV活性

表1 化合物1的1H (600 MHz)和13C (150 MHz) NMR核磁數(shù)據(jù)（氘代甲醇）Table 11H (600 MHz) and13C (150 MHz) NMR data of Compound 1 (CD3OD，δ in ppm)

的同時(shí)對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞本身的生長是否有影響。結(jié)果顯示，0.625 mmol·L-1時(shí)化合物1對(duì)細(xì)胞的抑制與陰性對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明此濃度下的化合物1對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞本身的生長沒有影響，即對(duì)細(xì)胞本身沒有毒性作用。其他濃度下均對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞正常生長有不同程度的抑制作用，即對(duì)細(xì)胞本身有毒性作用。但10 mmol·L-1時(shí)，化合物1和0.1 mmol·L-1拉米夫定組在細(xì)胞毒性上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 化合物1對(duì)HepG 2.2.15的細(xì)胞毒活性及其分泌HbsAg和HbeAg的抑制作用Table 2 Inhibition rate of Compound 1 on HbsAg and HbeAg secretion of HepG 2.2.15 cells (`c±s，n=3)

乙肝表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎E抗原（HBeAg）是肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15分泌到培養(yǎng)上清液中特異性的可溶性蛋白質(zhì)，能夠間接反映病毒復(fù)制狀況。因此，通過檢測用藥后細(xì)胞上清液中HBsAg和HbeAg的活性，觀察化合物1對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg和HbeAg的抑制作用，能夠確定其體外抗乙型肝炎病毒的活性。結(jié)果顯示，相對(duì)于陰性對(duì)照組，各濃度實(shí)驗(yàn)組所測A450 nm值均降低，且隨著濃度的增加，降低愈明顯。培養(yǎng)6 d后，化合物1 對(duì)HBsAg的IC50為4.37 mmol·L-1，TI為2.68；H12對(duì)HBeAg的IC50為4.89 mmol·L-1，TI為2.40。

3結(jié)論

通過現(xiàn)代分離技術(shù)和結(jié)構(gòu)鑒定方法，從廣西北侖河口采集從紅樹木欖（B. gymnorrhiza）胚軸中獲得新的1個(gè)生物堿類單體化合物gymnorrhizin A。活性測試發(fā)現(xiàn)，化合物gymnorrhizin A具有抗HBV活性，對(duì)HbsAg和HBeAg的IC50分別為4.37 mmol·L-1（TI=2.68）和4.89 mmol·L-1（TI=2.40）。

BUNYAPRAPHATSARA N，JUTIVIBOONSUKA，SORNLEK P，et al，2003. Pharmacological studies of plants in the mangrove forest [J]. Thai J Phytopharm，10(2): 1-12.

HEACOCK RA，HUTZINGER O，1962. Synthesis of potentially physiologically active β-phenylethylamines: PartⅠ. 3，4，5-trimethoxy-α-aminomethylenzyl alcohol and 4-acetoxy-3，5-dimethoxy-α-aminomethylenzyl alcohol derivatives [J]. C J Chem，40:128-132.

GAOCH，YI XX，HEBJ，et al，2011. Chemicalcompoundsandtheir bioactivitiesof mangroveplantin Guangxi[J]. J GuangxiAcad Sci，27(3):251-256. [高程海，易湘茜，何碧娟，等，2011.廣西紅樹植物化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展[J].廣西科學(xué)院學(xué)報(bào)，27（3）：251-256.]

JAYASINGHE L，KUMARIHAMY BMM，JAYARATHNA KHRN，et al，2003.Antifungal constituents of the stem bark of Bridelia retusa [J]. Phytochemistry，62(4): 637-641.

SHAO CL，F(xiàn)U XM，WANG CY，et al，2009. Investigation on the status of mangrove resources and medicinal research in ChinaⅢ. Status of folk medicinal usage and medicinal research [J]. Period Ocean Univ Chin，39(4):712-718. [紹長倫，傅秀梅，王長云，等，2009.中國紅樹林資源狀況及其藥用調(diào)查Ⅲ.民間藥用與藥物研究狀況[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，39（4）：712-718. ]

SUNJ，ZHENGXL，CUI XJ，et al，2014. Astudyof inhibition effects on hepatitis B virus of semi-cathayensis in vitro [J]. Lishizhen Med Mat Med Res，25(4):2 391-2 393. [孫靜，鄭雪凌，崔向珍，等，2014.半楓荷抗乙型肝炎病毒的藥理活性研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，25（4）：2 391-2 393.]

YI XX，GAO CH，HE BJ，et al，2013. Studyon phenylpropanoids from hypocotyls of the mangrove plant Bruguiera gymnorrhiza [J]. Guihaia，33(2):191-194. [易湘茜，高程海，何碧娟，等，2013.紅樹植物木欖胚軸中苯丙素類化學(xué)成分研究[J].廣西植物，33 （2）:191-194. ]

YI XX，GAO CH，LONG B，et al，2015. Study on chemical constituents from hypocotyls of mangrove Bruguiera gymnorrhiza [J]. J Chin Med Mat，38(1):86-89. [易湘茜，高程海，龍彬，等，2015.紅樹木欖胚軸中化學(xué)成分研究[J].中藥材，38（1）：86-89.]

10種中草藥提取物體外抗銅綠假單胞菌作用研究

謝俊杰1,2，韓 峻2，左國營1*，王 寧1，程子夢(mèng)1,2

( 1.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院天然藥物研究中心，昆明650032；2.云南中醫(yī)學(xué)院，昆明650500 )

摘 要：通過對(duì)粗糠柴等10種中草藥采用80%乙醇室溫下浸漬制備的提取物進(jìn)行體外抗銅綠假單胞菌及其耐藥菌活性研究，并采取藥敏紙片法測定臨床分離菌株的耐藥性。結(jié)果表明：這10種中草藥80%乙醇提取物中，粗糠柴的乙酸乙酯層對(duì)銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌及其耐藥菌的抑菌效果最好，其抑菌圈直徑范圍在10～17 mm之間，MIC范圍在0.125～0.5 mg·mL-1之間，MBC范圍在0.5～1 mg·mL-1之間；正丁醇層、水層的抑菌活性較乙酸乙酯層弱，石油醚層對(duì)銅綠假單胞菌沒有效果。而小葉藤黃、滇南紅厚殼、續(xù)隨子的乙酸乙酯層，巴豆、羅漢松、肉桂醇提物對(duì)銅綠假單胞菌及其耐藥菌株有較弱抗菌活性；滇南紅厚殼的正丁醇層、續(xù)隨子乙酸乙酯層以及大八角和郁金的醇提物對(duì)銅綠假單胞菌及其耐藥菌株均無活性。從這些數(shù)據(jù)中可以得出，粗糠柴的乙酸乙酯層、正丁醇層和水層對(duì)銅綠假單胞菌及其耐藥菌有較好的抑菌活性，尤以乙酸乙酯層活性最好，而粗糠柴的石油醚層沒有活性。

關(guān)鍵詞：中草藥，粗糠柴，銅綠假單胞菌，MIC/MBC，抗菌活性

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（NSFC 81173504）[Supported by the National Natural Science Foundation of China (NSFC 81173504)]。

作者簡介：謝俊杰（1990-），男，安徽六安人，碩士研究生，主要從事中草藥抗耐藥菌活性成分及耐藥機(jī)制研究，(E-mail)xjj7294@163.com。

*通訊作者：左國營，博士，主任藥師，博士后，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物活性成分研究和天然藥物開發(fā), (E-mail)zuoguoying@263.net。

Abstract: To investigate the in vitro antibacterial activities of 80% ethanol extracts from 10 Chinese herbal medicines against Pseudomonas aeruginosa and its resistant strains, the drug-resistance spectrum of 7 P. aeruginosa stains isolated from the clinical sputum samples was determined by the Kirby-Bauer (K-B) method. The dried powder of the collected 10 Chinese herbal medicine samples were extracted with 80 % ethanol and the solvent was evaporated under reduced pressure to get the Chinese herbal medicines ethanol extracts. The ethanol extracts were suspended in deioned water, then petroleum ether, ethyl acetate, and n-BuOH were used to extract successively. The activities of each extract against P. aeruginosa were screened of inhibition zone diameters (IZDs) by the agar-diffusion methods, and the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bactericidal concentration (MBC) were further determined by serial microdilution method. The data showed that of the 10 Chinese herbal medicines, the ethyl acetate extracts from Mallotus philippensis showed the most active against Pseudomonas aeruginosa and its resistant strains, with IZDs ranging by 10－17 mm, and the MICs and MBCs ranging by 0.125－0.5 mg·mL-1, respectively. The activities of n-BuOH and water extracts were slightly weaker,

whereas the petroleum ether extracts showed no activities against P. aeruginosa and its resistant strains. The ethyl acetate extracts from Garcinia cowa, Calophyllum polyanthum and Euphorbia lathyris, together with the ethanol extracts from Croton tiglium, Podocarpus macrophyllus and Cinnamomum cassia showed slightly weaker activities against P. aeruginosa and its resistant strains. The n-BuOH extracts from Calophyllum polyanthum, ethyl acetate extracts from Euphorbia lathyris and ethanol extracts from Illicium majus, and Curcuma aromatic all showed no activities against P. aeruginosa and its resistant strains. We could made a conclusion from those data that the ethyl acetate, n-BuOH and water extracts from M. philippensi. Arg had effective antibacterial activities against P. aeruginosa and its resistant strains, especially the ethyl acetate extracts showing the best activitity, compared with the others extracts,whereas the petroleum ether extracts showed no activities against P. aeruginosa and its resistant strains.

Key words: Chineseherbalmedicines,Mallotusphilippensi, Pseudomonasaeruginosa, MIC/MBC, antibacterial activity

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一種革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于自然界和人體中，是導(dǎo)致院內(nèi)感染的重要病原菌之一。在臨床上常見于一些呼吸道感染、尿路感染和免疫力低下的病人的痰液和尿液中，甚至?xí)饑?yán)重的囊性纖維化病(cystic fibrosis，CF) (Pier，2002)。臨床上常用的一些抗生素，銅綠假單胞菌都或多或少表現(xiàn)出耐藥性（趙津彩和張躍棟，2013）。中草藥因?yàn)榫哂胁涣挤磻?yīng)小，資源豐富、價(jià)格低，作用位點(diǎn)相對(duì)較多，不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)而越來越受到藥學(xué)和病原微生物研究者的關(guān)注。

本研究通過對(duì)粗糠柴等10種中草藥進(jìn)行體外抑菌活性研究，以篩選出來活性較好的中草藥，為深入研究其活性單體化合物和作用機(jī)制打下物質(zhì)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料

藥材：粗糠柴（Mallotus philippensis）、小葉藤黃（Garcinia cowa）、續(xù)隨子（Euphorbialathyris）、滇南紅厚殼（Calophyllum polyanthum）肉桂（Cinnamomum cassia）、郁金（Curcumaaromatic）、巴豆（Crotontiglium）、羅漢松（Podocarpus macrophyllus）、大八角（Illicium majus）、水楊梅（Adinarubella）均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

培養(yǎng)基：M-H（Mueller-Hinton）瓊脂培養(yǎng)基和M-H肉湯培養(yǎng)基（杭州天河微生物試劑有限公司）。

試劑：石油醚、乙酸乙酯、正丁醇均為工業(yè)級(jí)（重蒸后使用）；二甲基亞砜（DMSO）為分析純，均購自昆明福海達(dá)化玻儀器有限公司。

菌株：標(biāo)準(zhǔn)菌為銅綠假單胞菌（ATCC27853）購自中國藥物制品檢定所；耐藥菌株為PA135、PA216、PA276、PA281、PA291、PA314，PA319（從成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院臨床重癥呼吸系統(tǒng)患者的痰液標(biāo)本中分離得到），藥敏紙片由溫州市康泰生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 耐藥菌株的鑒定 藥敏測試按照抗菌劑藥敏常用測試方法的K-B紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer法）進(jìn)行。以Clinical and Laboratory Standards Institute （CLSI）2012版（CLSI：M02-A11，2012）推薦方法為判斷依據(jù)。

1.2.2 提取物的制備 將粗糠柴等藥材粉碎成粗粉，用80%乙醇分別浸泡7、5、3、1 d，合并濾液，減壓蒸發(fā)得到浸膏。浸膏用水分散，依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到石油醚層、乙酸乙酯層、正丁醇層和水層。減壓回收得到各個(gè)萃取層的浸膏備用。

1.2.3 藥液的制備 稱取各待測藥物，用1 mL二甲基亞砜（DMSO）溶解，配制成10 mg·mL-1的濃度，供打孔初篩使用；另取待測藥用肉湯和5%DMSO溶解藥物，制成16 mg·mL-1的溶液，用于測定MIC。

1.2.4 體外抑菌活性的測定

1.2.4.1 瓊脂打孔法測定抑菌圈 配制菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏臉?biāo)準(zhǔn)菌懸液濁度(1.5×108CFU·mL-1)。將已滅菌的M-H瓊脂培養(yǎng)基倒入滅過菌的培養(yǎng)皿上（厚度約5 mm）。然后在培養(yǎng)基上用直徑6 mm的無菌打孔器打孔。用無菌棉簽蘸取適量的菌液擠去多余的液體后，均勻涂抹在打好孔的培養(yǎng)基表面。最后于每孔中加入50 μL制備好的藥液，放置在（37±2）℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.4.2 MIC的測定 微量稀釋法測定MIC，均按照CLSI2012版指南進(jìn)行（CLSI:M07-A9,2012）。

1.2.4.3 MBC的測定 確定MIC后，取MIC前3～5孔的培養(yǎng)物，接種到不含藥的MH培養(yǎng)基上，在（37±2）℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。采用活菌計(jì)數(shù)法檢查瓊脂平板上的菌落數(shù)量，當(dāng)菌落數(shù)少于5個(gè)的最小藥物濃度即為此藥的MBC（楊翠先等，2012）。

表1 7株耐藥菌株的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Drug sensitive test result of 7 resistant strains

2結(jié)果與分析

2.1 7 株耐藥菌株的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過對(duì)7株臨床分離的銅綠假單胞菌的藥敏試驗(yàn)檢測，所測結(jié)果如表1。從表1可以看出，這7株菌株已對(duì)臨床上常用的一些抗生素產(chǎn)生了耐藥，而且表現(xiàn)出多重耐藥的趨勢(shì)。

2.2 10 種中草藥提取物體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表2、表3和表4看出，粗糠柴的石油醚層對(duì)銅綠假單胞菌及其耐藥菌株沒有抑菌效果；乙酸乙酯層對(duì)標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌和耐藥菌株具有較好的抑菌效果，抑菌圈在10.5～18 mm之間；正丁醇層對(duì)標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌和耐藥菌株具有較好的抑菌效果，抑菌圈在12～16 mm之間；水層標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌和耐藥菌株具有較好的抑菌效果，抑菌圈在11～15 mm之間。說明粗糠柴的乙酸乙酯層、正丁醇層、水層、石油醚層的抑菌活性逐漸降低，而其他9種中草藥對(duì)銅綠假單胞菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株及其耐藥菌株的抑菌效果較差。此外，這10種中草藥還對(duì)標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌也有較好的抑菌效果。

3討論與結(jié)論

本研究所使用的耐藥菌株均是從本院臨床重癥患者的痰液中分離得到的，這7株耐藥菌株對(duì)臨床上現(xiàn)有使用的多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性。這提示我們?cè)谂R床用藥上應(yīng)該充分結(jié)合藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果合理用藥，以提高治療效果。

隨著抗生素耐藥問題的日益嚴(yán)重，現(xiàn)有抗生素的治療效果日益降低。從天然藥物中發(fā)現(xiàn)新的有效的化學(xué)成分已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。在醫(yī)院患者微生物感染中，革蘭陰性菌的檢出率明顯高于革蘭陽性菌，而且銅綠假單胞菌在檢出的革蘭陰性菌中居于首位(黃傳正等，2015；李玉梅等，2015)，由此看出，革蘭陰性菌感染在臨床上是亟待解決的一問題。近年來銅綠假單胞菌耐藥性的產(chǎn)生，給臨床治療帶來嚴(yán)重挑戰(zhàn)。武曉敏等（2014）通過對(duì)臨床分離的711株銅綠假單胞菌的耐藥性分析和分布情況分析，發(fā)現(xiàn)這711株菌株對(duì)頭孢唑啉、復(fù)方大新諾明、頭孢呋辛酯、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、呋喃妥因、頭孢呋辛耐藥率均達(dá)95.00%，且這711株菌株中，89.59%來自于痰標(biāo)本。因此加大對(duì)抗銅綠假單胞菌的中草藥活性成分的研究具有較大意義。本研究中，我們通過對(duì)粗糠柴10種中草藥提取物對(duì)銅綠假單胞菌及其耐藥菌株的抗菌活性篩選，在這10種中草藥中，粗糠柴的乙酸乙酯層對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效果明顯優(yōu)于其他各個(gè)萃取層和其他中草藥，為以后進(jìn)一步追蹤其抗菌成分提供了依據(jù)。粗糠柴在驅(qū)蟲方面具有很好的效果，特別是在腸道絳蟲方面的應(yīng)用（Mayank et al，2013）；此外在抗炎止痛（Mohammad et al，2010）、抗血管生成（Giuseppe et al，2011）和抗氧化（Muhammad et al，2009）等方面也有一定效果。但是在抗菌方面，目前只有Syed et al（2009）報(bào)道過從粗糠柴中提取出一種成分對(duì)耐克拉霉素和甲硝唑的幽門螺桿菌有很好的抑菌效果，對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用及其活性成分還未見報(bào)道。蔡蕓等（2007）研究發(fā)現(xiàn)大蒜素與頭孢哌酮聯(lián)用有協(xié)同抗銅綠假單胞菌的作用，可明顯降低頭孢哌酮的用量。國內(nèi)外關(guān)于中草藥與抗生素聯(lián)用抗菌的報(bào)道(王春娟等，2014; Francisco et al，2013)，提示可以從聯(lián)合用藥方面來評(píng)價(jià)中草藥的抗菌活性。根據(jù)本研究結(jié)果，通過進(jìn)一步追蹤活性成分，從粗糠柴中得到對(duì)銅綠假單胞菌有效的化學(xué)成分，為進(jìn)一步研究其與抗生素聯(lián)用抗銅綠假單胞菌的作用效果提供一定的指導(dǎo)作用。

表2 10種中草藥提取物體外抑菌實(shí)驗(yàn)的抑菌圈直徑Table 2 Inhibition zones diameters of 10 Chinese herbal medicines extracts in vitro antimicrobial activity (mm)

參考文獻(xiàn)：

CAI Y, NI SX, PEI F, et al, 2007. Antibacterial activity of allicin combined with cefoperazone against Pseudomonas aeruginosa [J]. Chin J Nosocominol, 17(12):1 559-1 561. [蔡蕓,倪淑欣,裴斐,等, 2007.大蒜素與頭孢哌酮聯(lián)用對(duì)銅綠假單胞菌的藥敏研究) [J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志), 17(12):1 559-1 561.]

表3 10種中草藥提取物對(duì)PAS及其耐藥菌株體外抑菌MIC值Table 3 MIC of 10 Chinese herbal medicines extracts against PAS and its resistant strains (mg·mL-1)

Clinical and Laboratory Standards Institute, 2012. Performance standards for antimicrobial disk susceptility tests [S]. Approved Standard-Eleventh Edition M02-A11. Wayne, PA: CLSI2012.

Clinical and Laboratory Standards Institute, 2012. Performance standards for antimicrobial disk susceptility tests [S]. Approved Standard-Eleventh Edition M07-A9. Wayne, PA: CLSI2012.

FRANCISCO FMO, ALBA FT, THIALLY BG, et al, 2013. Efficacy of Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng in a murine of methicillin-resistant Staphylococcus aureus skin abscesses [J]. Evid-based Compl Altern:1-9.

GIUSEPPE V, ALESSANDRA P, CLAUDIA S, 2011. Rottlerin exhibits antiangiogenic effects in vitro [J]. Chem Biol Drug Des, 77:460-470.

HUANG CZ, WANG L, DENG JP，2015. Analysis of 246 cases of hospitalized patients with urinary tract infect pathogenic bacteria distribution and drug resistance [J]. Int J Lab Med, 36(5):686-687.[黃傳正,汪莉,鄧建平，2015. 246例住院患者尿路感染病原菌分布及耐藥性分析[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 36(5):686-687.]

LI YM, AN HZ，2015. Identification and drug sensitive test of bacteria isolated from clinical specimens: a hospital-based analysis [J]. Chin J Public Health, 31(3):383-384. [李玉梅,安宏志，2015.醫(yī)院細(xì)菌分離培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析[J].中國公共衛(wèi)生, 31(3):383-384.]

MAYANK G, VIJAY CV, TRYAMBAK DS, et al, 2013. In vitro scolicidal activity of Mallotus philippinensis (Lam.) Muell Arg. fruit glandular hair extract against hydatid cyst Echinococcus granulosus [J].Asian Pac J Trop Med, 595-601.

MOHAMMAD A, HAZRAT A, NEMATULLAH K, et al, 2010. Analgesic and anti-inflammatory activities of 11-o- galloylbergenin [J].J Ethnopharmacolog,131:502-504.

MUHAMMAD A, HAZRAT A, MAGDALENA K, et al, 2009. Antioxidant activity of phenolic fractions of Mallotus philippinensis bark extract [J]. Czech J Food Sci, 277(2): 109- 117. PIER GB, 2002. CFTR mutations and host susceptibility to Pseudomonas aeruginosa lung infection [J]. Curr Opin Microbiol, 5(1):81-86.

SYED FHZ, IKUKO Y, FARHANA B, et al, 2009. Potent bactericidal constituents from Mallotus philippinensis against clarithromycin and metronidazole resistant strains of Japanese and Pakistani Helicobacter pylori [J]. Biol Pharm Bull, 32(4): 631-636.

WANG CJ，ZUO GY，WANG GC，2014. Antimicrobial activity of gallic acid combined with 5 kinds of antibiotics against Pseudomonas aeruginosa in vitro [J]. Chin Pharm, 25(1):25-27. [王春娟，左國營，王根春，2014.沒食子酸與5種抗生素聯(lián)用對(duì)銅綠假單胞菌的體外抑菌活性[J].中國藥房，25(1): 25-27.]

表4 10種中草藥提取物對(duì)PAS及其耐藥菌株體外抑菌MBC值Table 4 MBC of 10 Chinese herbal medicines extracts against PAS and their resistant strains (mg·mL-1)

WU XM, ZHANG LY, GUO RJ, et al, 2014. Distribution of 711 strains Pseudomonas aeruginosa from clinical and its drug resistance [J]. Chin Prac Med, 9(15):143-144. [武曉敏,張麗媛,郭瑞娟,等, 2014. 711株銅綠假單胞菌醫(yī)院感染分布及耐藥性研究[J].中國實(shí)用醫(yī)學(xué), 9(15):143-144.]

YANG CX, ZUO GY, HAN J, et al, 2012.Antimicrobial activities of 26 Yunnan plants extracts against clinical multi-drug resistant pathogens in vitro [J]. Guihaia, 32(3):400-405. [楊翠先,左國營),韓峻, et al, 2012. 26種滇產(chǎn)植物提取物的體外抗耐藥菌作用研究) [J].廣西植物, 32(3):400-405.]

ZHAO JC, ZHANG YD，2013. Distribution of 520 strains Pseudomonas aeruginosa from clinical and its drug resistance [J]. Lab Med, 28(8):734-736. [趙津彩,張躍棟，2013. 520株銅綠假單胞菌臨床分布和耐藥性分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué), 28(8):734-736.]

Anew antiviral alkaloid from the hypocotyl of Bruguiera gymnorrhiza

CHENZhi-Yong1，QUCai-Hong1，LU Jing1，CHENGGang1，GAOCheng-Hai2*
（1. Dalian Air Force Sergeant School of Communication，Dalian 116600，China; 2. Guangxi Key Laboratory of Marine Environmental Science，Guangxi Academy of Sciences，Nanning 530007，China )

Bruguiera gymnorrhiza is a common buttressed tree found in the mangrove forests. The hypocotyl of a mangrove B. gymnorrhiza are traditionally used as food and herbal medicine in Guangxi. A new alkaloid (1) was isolated from the hypocotyl of a mangrove B. gymnorrhiza and purified by repeated column chromatography on silica and HPLC. The structure of Compound 1 was elucidated on the basis of extensive spectroscopic analysis (HRMS，1H NMR，13C NMR，DEPT，1H-1H COSY，HSQC and HMBC). Compound 1 was a new compound by the method of SciFinder scholar，and it showed that anti-Hepatitis B virus (HBV) activity against HbsAg and HbeAg with IC50values of 4.37 mmol·L-1and 4.89 mmol·L-1，and TI values of 2.68 and 2.40，respectively. The hypocotyl of a mangrove B. gymnorrhiza has been commonly used as crude material of herbal medicine for a long time，and this study would accumulate data for chemical constituents research of the genus.

natural product research，alkaloid，HbsAg，HbeAg，therapeutic index

Antibacterial activity screening of 10 Chinese herbal medicines against Pseudomonas aeruginosa in vitro

XIE Jun-Jie1,2，HAN Jun2，ZUO Guo-Ying1*，WANG Ning1，CHENG Zi-Meng1,2

（1. Research Center for Natural Medicines, Kunming General Hospital of Chengdu Military Command，Kunming 650032，China；2. Yunnan Traditional Chinese Medical University，Kunming 650500，China )

Q946.88，R914.4

A

10000-3142（2016）02-0236-04

10.11931/guihaia.gxzw201507009

陳志勇，曲彩紅，盧靜，等.木欖胚軸中一個(gè)新生物堿及其抗乙肝病毒活性研究［J］.廣西植物，2016，36(2)：236-239

CHEN ZY，QU CH，LU J，et al. Anew antiviral alkaloid from the hypocotyl of Bruguiera gymnorrhiza［J］. Guihaia，2016，36(2)：236-239

2015-07-11

2015-11-30

廣西自然科學(xué)基金（2014GXNSFAA118048，2015GXNSFBA139195）；廣西近海海洋環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（GXKLHY13-06) [Supported by the Natural Science Foundation of Guangxi（2014GXNSFAA118048; 2015GXNSFBA139195）；Guangxi Open Fund For Key Laboratory of Marine Environmental Science（GXKLHY13-06）]。

陳志勇（1969-），男，江蘇丹陽人，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤和病毒疾病及相關(guān)藥物的研究，（E-mail）czyyy-1@126.com。

*通訊作者：高程海，博士，研究員，主要從事海洋藥物研究，（E-mail）gaochenghai@gxas.cn。

中圖分類號(hào)：Q946，R285.5

A 文章編號(hào)：1000-3142（2016）02-0240-06

DOI: 10.11931/guihaia.gxzw201502015

謝俊杰，韓峻，左國營，等. 10種中草藥提取物體外抗銅綠假單胞菌作用研究［J］.廣西植物，2016，36(2)：240-245

XIE JJ，HAN J，ZUO GY，et al. Antibacterial activity screening of 10 Chinese herbal medicines against Pseudomonas aeruginosa in vitro［J］. Guihaia，2016，36(2)：240-245

收稿日期：2015-02-15

2015-09-10