竹節參齊墩果烷皂苷對RAW264.7巨噬細胞SIRT1活性影響及抗炎作用研究

袁 琴，袁 丁，2，周志勇，劉朝奇，王 婷，向婷婷，張長城

［1.三峽大學醫學院國家中醫藥（腫瘤）管理局三級實驗室，湖北宜昌 443002；2.仁和醫院，三峽大學第二臨床醫學院，湖北宜昌 443001］

竹節參齊墩果烷皂苷對RAW264.7巨噬細胞SIRT1活性影響及抗炎作用研究

袁 琴1，袁 丁1，2，周志勇1，劉朝奇1，王 婷1，向婷婷1，張長城1

［1.三峽大學醫學院國家中醫藥（腫瘤）管理局三級實驗室，湖北宜昌 443002；2.仁和醫院，三峽大學第二臨床醫學院，湖北宜昌 443001］

目的 探討竹節參齊墩果烷皂苷（chikusetsu oleanane saponin，COS）對脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激RAW264.7巨噬細胞的SIRT1活性影響及抗炎作用。方法Griess法測定一氧化氮（NO）釋放量；免疫印跡（Western blot）法檢測炎性因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素1β （IL-1β）蛋白表達；免疫熒光分析COS對細胞核因子-κB（NF-κB）和沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）核轉運的作用。結果 COS在25～300 mg·L－1與1 mg·L－1LPS共培養時，對RAW264.7細胞生長無明顯影響；與LPS組相比，COS能有效抑制NO釋放和抑制TNF-α、IL-1β的分泌；還能抑制NF-κB的核移位，上調SIRT1的表達。結論 COS對LPS刺激的RAW264.7細胞炎癥具有保護作用，其保護機制可能是COS上調SIRT1表達，促進NF-κB去乙酰化作用，從而抑制NF-κB的核移位，減少TNF-α、IL-1β等炎癥因子的產生。

竹節參齊墩果烷皂苷；RAW264.7細胞；脂多糖；一氧化氮；TNF-α；IL-1β；NF-κB；SIRT1

竹節參為五加科植物竹節參Panax japonicus.C.A.Mey.的根狀莖及肉質塊根，是我國名貴中草藥，具有補虛強壯、活血祛瘀、止血祛痰等功效。竹節參的主要有效成分為竹節參皂苷，竹節參皂苷提取物主要以竹節參齊墩果烷皂苷（chikusetsu olean-ane saponin，COS）為主，尚有少量達瑪烷型皂苷。藥理研究顯示，竹節參總皂苷具有抗炎等多種藥理作用［1－3］，但是COS及其抗炎機制的研究報道甚少。本研究在前期研究基礎上，擬建立LPS致RAW264.7細胞炎癥模型，探討COS對RAW264.7細胞的SIRT1活性影響及其抗炎作用，為竹節參的臨床應用提供理論基礎和實驗依據。

1 材料

1.1 藥品與試劑 竹節參采購于湖北省恩施椿木營竹節參種植基地，經三峽大學湖北省天然產物研究與利用重點實驗室鄒坤教授鑒定為五加科人參屬植物Panax japonicus C.A.Mey。D101大孔吸附樹脂（上海勤實科技有限公司）；人參皂苷Re（純度＞98％，成都植標化純生物技術有限公司）；小鼠RAW264.7細胞系購于中國科學院上海細胞庫；DMEM高糖培養基（Gibco公司）；胎牛血清（Scien Cell公司）；脂多糖（LPS，Sigma公司）；一氧化氮（NO）試劑盒（碧云天生物公司）；蛋白預染marker、RIPA細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司）；化學發光劑ECL（碧云天生物技術研究所）；Triton X-100（Solarbio公司）；DAPI（武漢科瑞生物技術）；NF-κB p65抗體（美國Cell Signaling公司）；β-actin、TNF-α、IL-1β抗體（美國Santa Cruz公司）；SIRT1抗體（美國Millipore公司）；PE標記山羊抗小鼠、FITC標記山羊抗兔（美國Santa Cruz公司）。

1.2 主要儀器 NU-4750E型二氧化碳培養箱（Nu Aire公司），CKX41倒置顯微鏡（日本，Olympus公司），NIKON TP1020倒置熒光顯微鏡（上海衡橋儀器有限公司），CT15RT高速冷凍離心機（上海天美生化儀器設備工程有限公司），Thermo全波長酶標儀（芬蘭，Tecan Inpinifetm 200）。

2 方法

2.1 COS制備 將1 kg竹節參藥材粉碎，加入10倍量體積分數為0.65的乙醇浸泡2 h，加熱回流提取3次，每次2 h，合并、減壓回收、濃縮得竹節參醇提物；水溶提取物，用正丁醇萃取直到正丁醇層幾乎無色為止，分離、合并、減壓回收、濃縮得到正丁醇萃取物，將萃取物上樣到D101大孔吸附樹脂上，用體積分數為0.95的乙醇進行梯度洗脫，將所得到的洗脫物減壓濃縮干燥，即得COS，得率為16.8％。精確稱取干燥的COS粉末和人參皂苷Re標準品各0.1 g，置于容量瓶中，精密加入甲醇8 mL，超聲溶解，再加入甲醇定容至10 mL，搖勻過濾，加入到HPLC分析瓶中，記錄COS的HPLC。應用HPLC進行指紋圖譜分析，并且應用標準品進行成分鑒定。實驗前用DMSO溶解配成400 g·L－1的母液，再用培養基稀釋至所需質量濃度。

2.2 COS的HPLC分析 色譜條件：色譜柱為YMC-pack ODS-AQ柱（250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.4％磷酸水溶液（B）；柱溫30℃；洗脫方式為梯度洗脫（0～5 min，5％～5％ A；5～20 min，5％～30％A；20～30 min，30％～30％A；30～50 min，30％～85％A；50～60 min，85％～85％A）；檢測波長203 nm；進樣量10 μL；流速1.0 mL·min－1。

2.3 細胞培養 RAW264.7細胞用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養基培養，放置于37℃、5％ CO2培養箱中，取對數期細胞用于實驗。

2.4 COS對RAW264.7細胞生長的影響RAW264.7細胞懸液以5×104/孔接種于96孔板，每孔100 μL，貼壁4 h后，設置正常對照組（細胞＋培養基）、模型LPS組（細胞＋LPS）、陰性對照組（細胞＋DMSO）、實驗組（細胞＋COS），每組4個復孔。COS給藥質量濃度為25、50、100、150、200、300、400 mg·L－1，20 h后吸取上清液，在每孔中加入終濃度為0.5 g·L－1MTT（5 g·L－1，PBS配制）10 μL，繼續培養4 h后棄上清，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速震蕩10 min，在570 nm處測量各孔的吸光度。

2.5 不同濃度COS對LPS誘導的RAW264.7細胞釋放NO的檢測 RAW264.7細胞懸液按2× 105/孔接種于96孔板中，每孔50 μL，貼壁4 h后，加入25 μL不同濃度的COS（正常對照組或LPS模型組加入25 μL培養基）孵育2 h，給藥質量濃度為50、100、150、200、300 mg·L－1，每組4個復孔，再加入25 μL終濃度為1 mg·L－1的LPS刺激（正常對照組加入25 μL培養基）20 h，Griess法測定上清液中NO含量。

2.6 Western blot法檢測RAW264.7細胞TNF-α、IL-1β表達 RAW264.7細胞懸液按1×106/孔接種于6孔板，每孔1 mL，4 h貼壁后，先加入100、200、300 mg·L－1的COS 500 μL（正常對照組或LPS模型組加入500 μL培養基）孵育2 h，再加入1 mg ·L－1LPS 500 μL刺激（正常對照組加入500 μL培養基）20 h后，提細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量法檢測各組細胞蛋白濃度，95℃滅活蛋白5 min，SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，5％脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL顯色。

2.7 SIRT1、NF-κB的免疫熒光分析 取對數期RAW264.7細胞懸液（調細胞密度為1×106/孔）每孔1 mL接種于6孔板內無菌蓋玻片上，待細胞貼壁50％即可給予300 mg·L－1的COS 500 μL干預（正常對照組或LPS模型組加入500 μL培養基），孵育2 h后加入1 mg·L－1LPS 500 μL刺激（正常對照組加入500 μL培養基）12 h后，棄去培養基，在6孔板中將已經爬好細胞的爬片用PBS浸洗3次，每次5 min；4％多聚甲醛固定爬片20 min，PBS浸洗3次，每次5 min；1％Triton X-100（PBS配制）37℃通透30 min，PBS浸洗3次，每次5 min；滴加5％山羊血清37℃封閉1 h，棄掉封閉液，直接加入一抗（1 ∶100，PBS稀釋）4℃過夜；24 h后PBS浸洗3次，每次5 min，再加入熒光二抗（1∶200，PBS稀釋）37℃避光孵育1 h，PBS浸洗3次，每次5 min；滴加DAPI避光孵育5 min，PBS浸洗3次，每次5 min，甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

2.8 統計學處理 采用GraphPad Prism 5軟件，Western blot結果采用Image J軟件分析，計量資料采用±s表示，全部數據采用SPSS 18.0統計軟件進行分析，以單因素方差分析進行多組比較。

3 結果

3.1 HPLC圖譜結果 將竹節參皂苷提取物再經過大孔樹脂進一步分離，并進行HPLC圖譜分析。竹節參提取物主要含5個皂苷成分，即人參皂苷Re、竹節參皂苷Ⅴ、竹節參皂苷Ⅱ、竹節參皂苷Ⅳ和竹節參皂苷Ⅳa［4］。Fig 1中達瑪烷型人參皂苷Re已經幾乎沒有，而其它4種齊墩果烷型皂苷含量較高，未見多糖吸收峰。因此得出，體積分數為0.95的乙醇洗脫大孔樹脂所得的皂苷是COS，即竹節參皂苷Ⅴ、竹節參皂苷Ⅱ、竹節參皂苷Ⅳ和竹節參皂苷Ⅳa。

Fig 1 90％ethanol elution of Panax japonicus saponins by HPLC analysis

3.2 COS對RAW264.7細胞生長的影響 當COS在25～300 mg·L－1與1 mg·L－1LPS共培養時，與正常對照組相比，對RAW264.7細胞生長無明顯影響；400 mg·L－1時，表現出明顯的細胞生長抑制效應，即細胞活力明顯下降至53.2％，見Fig 2。

Fig 2 Effect of COS on viability of RAW264.7 cells

3.3 COS對NO釋放量的影響 如Fig 3所示，與正常對照組相比，1 mg·L－1LPS刺激24 h后，RAW264.7細胞釋放NO的量明顯增加，表明LPS能明顯誘導RAW264.7細胞釋放NO；與LPS組相比，COS能較好地抑制NO釋放，并呈良好的劑量依賴性。

Fig 3 Effect of NO release after intervention of COS in RAW264.7 cells stimulated by LPS

3.4 COS對TNF-α、IL-1β表達的影響 與正常組相比，LPS組的TNF-α表達升高，IL-1β表達明顯升高（P＜0.01），而在COS組分存在時，TNF-α和IL-1β的表達則受到明顯抑制，并表現一定的劑量依賴性關系，見Fig 4。

3.5 COS對NF-κB活性的影響 如Fig 5所示，DAPI將細胞核染成藍色，染成紅色的為NF-κB陽性細胞，及將圖片疊加的結果。對于NF-κB來說，正常對照組中幾乎所有細胞中NF-κB主要集中在胞質部位，使胞質染色較深，反映NF-κB為無活性狀態；LPS組NF-κB陽性主要集中在胞核部位，反映NF-κB為活化狀態；COS組NF-κB活化細胞明顯少于LPS組。

Fig 4 Effect of TNF-α and IL-1β expression after intervention of COS in RAW264.7 cells stimulated by LPS

Fig 5 Effect of COS on NF-κB p65 translocation in RAW264.7 cells observed under LSCM

Fig 6 Effect of COS on SIRT1 translocation in RAW264.7 cells observed under LSCM

3.6 COS對SIRT1活性的影響 如Fig 6所示，染成藍色的是細胞核，染成綠色的為SIRT1，第3列圖片均為前兩張重合的結果。和正常對照組相比，LPS組中SIRT1的表達降低，COS處理后，SIRT1的表達增加。由此得出，LPS誘導可使細胞表達SIRT1蛋白降低，COS可以促進SIRT1蛋白的表達。

4 討論

炎癥是機體對外界刺激的適應性反應，是十分常見而又重要的基本病理過程，具有防御和損傷雙重效應。巨噬細胞是主要的炎性細胞，LPS即革蘭氏陰性菌細胞壁組成成分，是引發機體炎癥的重要物質。研究發現，當巨噬細胞受到LPS刺激時活化TLR4受體，會釋放NO、IL-1β、TNF-α等重要的炎癥細胞因子［3，5－6］。TNF-α和IL-1β是由單核-巨噬細胞和內皮細胞分泌產生的一種重要的前炎細胞因子，是早期炎癥的標志物，介導炎癥反應。NF-κB是一種介導細胞內信號轉導的早期核轉錄因子，NF-κB p65是NF-κB轉錄因子家族的重要成員，在炎癥反應中發揮關鍵作用。炎癥反應各階段的很多分子都受NF-κB的調控。在靜息狀態下，NF-κB與其抑制因子IκB形成復合體，使NF-κB以無活性的形式存在于胞質中。當受到刺激后，IκB激酶復合體（Iκ kinase，IKK）活化，使IκB磷酸化而酶解，從而能使NF-κB與IκB解離，游離的NF-κB迅速易位到細胞核，與DNA相關元件結合，誘導TNF-α、IL-1β的細胞因子的產生，介導炎癥反應。

SIRT1是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙酰化酶，與細胞衰老、炎癥反應、抗氧化應激和能量代謝調節等細胞多種功能活動有關。越來越多的研究發現，NF-κB的活性受SIRT1的調節，SIRT1可直接去乙酰化NF-κB的p65亞基第310位的賴氨酸殘基，RelA/p65亞單位不能與IκBα結合，從而使NF-κB進入核內，誘導相關基因表達。進而抑制NF-κB的活性，從而抑制下游基因的表達［7］。

研究發現，齊墩果烷型皂苷經水解后可產生齊墩果酸，齊墩果酸具有抗炎、抗氧化［8-9］等多種生物活性。本實驗通過對竹節參回流提取、正丁醇萃取所得竹節參總皂苷提取物進行進一步分段（體積分數為0.95的乙醇洗脫物），應用HPLC對其進行指紋圖譜分析，并且應用標準品進行成分鑒定，發現體積分數為0.95的乙醇洗脫物主要成分為COS。有研究報道，齊墩果烷皂苷具有抗炎活性［10］。本研究發現，經LPS誘導的RAW264.7細胞SIRT1表達減少，使入核的NF-κB蛋白增加。COS可以促進SIRT1蛋白的表達，抑制NF-κB的核移位，從而減少TNF-α、IL-1β等炎癥因子的產生。本實驗結果提示，COS可以激活SIRT1，對LPS誘導的RAW264.7細胞具有保護作用，其機制可能是SIRT1通過去乙酰化作用于NF-κB的p65亞基第310位的賴氨酸殘基，抑制NF-κB的核移位，進而減少TNF-α、IL-1β等炎癥因子的產生。由此我們相信SIRT1可作為抗炎治療的靶點。

（致謝：本實驗完成于三峽大學醫學院國家中醫藥管理局中藥藥理科研三級實驗室。感謝醫學院實驗中心和腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室對本課題提供的支持與幫助，感謝本課題組全體老師和同學對我實驗的幫助。）

［1］ 代艷文，袁 丁，萬靜枝，等.竹節參總皂苷通過NF-κB通路對LPS致RAW264.7細胞炎癥的保護作用研究［J］.中國中藥雜志，2014，39（11）：2076－80.

［1］ Dai Y W，Yuan D，Wan J Z，et al.Study on protective effect of to-tal saponins of Panax japonicus on LPS-induced RAW264.7 cell inflammation through NF-kappaB pathway［J］.Chin J Chin Mat Med，2014，39（11）：2076－80.

［2］ 代艷文，楊 莉，萬靜枝，等.竹節參醇提物對LPS誘導RAW264.7細胞炎癥的保護作用［J］.中國實驗方劑學志，2014，20（2）：163－6.

［2］ Dai Y W，Yang L，Wan J Z，et al.Protective effect of panax japoni-cus ethanol extract on the inflammation of RAW264.7 cells in-duced by LPS［J］.Chin J Exp Tradit Med Form，2014，20（2）：163－6.

［3］ Wang T，Dai Y，Dun Y，et al.Chikusetsusaponin V inhibits in-flammatory responses via NF-κB and MAPK signaling pathways in LPS-induced RAW 264.7 macrophages［J］.Immunopharmacol Immunotoxicol，2014，36（6）：404－11.

［4］ 李玉洲，何毓敏，孫志偉，等.不同栽培年限竹節參中主要成分含量的動態變化［J］.安徽農業科學，2011，39（33）：20411－3.

［4］ Li Y Z，He S M，Sun Z W，et al.Study on the dynamic variation of the main constituents of P.japonicas in different cultivating years ［J］.J Anhui Agri，2011，39（33）：20411－3.

［5］ 李曉紅，齊 云，蔡潤蘭，等.蘆薈大黃素對LPS誘導的RAW264.7細胞NO生成及iNOS表達的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26（4）：488－92.

［5］ Li X H，Qi Y，Cai R L，et al.Effect of lipopolysaccharide-induced expression of inducible nitric oxide synthase by aloe-emodin in RAW264.7 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26（4）：488－92.

［6］ 蔡海蘭，黃曉君，聶少平，等.鐵皮石斛多糖對RAW264.7細胞分泌TNF-α的影響［J］.中國藥理學通報，2012，28（11）：1553 －6.

［6］ Cai H L，Huang X J，Nie S P，et al.Effects of polysaccharides from dendrobium officinale on the production of TNF-α by RAW264.7 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（11）：1553－6.

［7］ Jung Y J，Lee J E，Lee A S，et al.SIRT1 overexpression decrea-ses cisplatin-induced acetylation of NF-κB p65 subunit and cyto-toxicity in renal proximal tubule cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，419（2）：206－10.

［8］ 張明發，沈雅琴.齊墩果酸和熊果酸的抗炎及其抗變態反應［J］.抗感染藥學，2011，8（4）：235－40.

［8］ Zhang M F，Shen Y Q.Anti-inflammation and anti-allergy of oleanolic acid and ursolic acid［J］.Anti Infect Pharm，2011，8 （4）：235－40.

［9］ 唐 初，陳 玉，柏 舜，等.齊墩果酸的結構修飾與生物活性研究進展［J］.有機化學，2013，8（1）：46－65.

［9］ Tang C，Chen Y，Bai Y，et al.Advances in the study of structural modification and biological activities of oleanolic acid［J］.J Org Chem，2013，8（1）：46－65.

［10］Li W，Yan X T，Sun Y N，et al.Anti-inflammatory and PPAR transactivational effects of oleanane-type triterpenoid saponins from the roots of pulsatilla koreana［J］.Biomol Ther（Seoul），2014，22（4）：334－40.

Anti-inflammatory effect of Chikusetsu oleanane saponin on RAW264.7 cell through regulating SIRT1 activity

YUAN Qin1，YUAN Ding1，2，ZHOU Zhi-yong1，LIU Chao-qi1，WANG Ting1，XIANG Ting-ting1，ZHANG Chang-cheng1
（1.Third-grade Pharmacological Laboratory on Traditional Chinese Medicine Approved by Stste Adiministration of Traditional Chinese Medicine，College of Medical Science，China Three Gorges University，Yichang Hubei 443002，China；2.Renhe Hospital，the Second College of Clinical Medical Science，China Three Gorges University，Yichang Hubei 443001，China）

Aim To investigate SIRT1 activity and an-ti-inflammatory effects of Chikusetsu oleanane saponin （COS）on the RAW264.7 macrophage cells induced by lipopolysaccharide（LPS）.Methods The nitric oxide（NO）release was detected with Griess method.Western blot was used to detect the expression of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin 1β（IL-1β）.Nuclear factor-κB（NF-κB）and silent information ad-justment factor 1（SIRT1）were tested by immunofluo-rescence.Results 1 mg·L－1LPS co-cultured with COS at 25～300 mg·L－1had no significant effect on the growth of RAW264.7 cells.Compared with the LPS group，COS effectively inhibited the NO release and suppressed the expression of TNF-α and IL-1β，and also inhibited the translocation of NF-κB and up-regulation of SIRT1.Conclusion COS has protective effects on RAW264.7 cells stimulated by LPS，which may be related to up-regulating the expression of SIRT1 and promoting the deacetylation of NF-κB，thereby in-hibiting the translocation of NF-κB and reducing the expression of TNF-α and IL-1β.

COS；RAW264.7 cells；LPS；NO；TNF-α；IL-1β；NF-κB；SIRT1

時間：2016－2－26 10：20 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.022.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.011

A

1001－1978（2016）03－0349－06

R284.1；R329.24；R364.5；R392.12

2015－10－22，

2015－11－30

國家自然科學基金資助項目（No 81273895）；湖北省自然科學基金重點項目（No 2013CFA014）

袁 琴（1991－），女，碩士生，研究方向：中藥藥理學，E-mail：780210109＠qq.com；張長城（1973－），男，博士，教授，研究方向：中藥藥理學，通訊作者，E-mail：greatwall＠ctgu.edu.cn