轉化生長因子-β激活激酶1抑制劑對AGEs誘導小鼠骨髓來源巨噬細胞活化作用及機制

付 欣，徐興欣，邵云俠，馮世堯，李媛媛，吳永貴

（安徽醫科大學第一附屬醫院腎內科，安徽合肥 230022）

轉化生長因子-β激活激酶1抑制劑對AGEs誘導小鼠骨髓來源巨噬細胞活化作用及機制

付 欣，徐興欣，邵云俠，馮世堯，李媛媛，吳永貴

（安徽醫科大學第一附屬醫院腎內科，安徽合肥 230022）

目的 應用轉化生長因子-β激活激酶1（TGF-β acti-vated kinase-1，TAK1）抑制劑（5Z-7-oxozeaenol，OZ）作用于晚期糖基化終末產物（adavnaced glyeation end porudets，AGEs）誘導的小鼠骨髓來源巨噬細胞（bone marrow-derived macro-phages，BMMs），探討TAK1信號通路在AGEs誘導的BMMs活化中作用及機制。方法 獲取C57小鼠的BMMs，運用流式細胞術鑒定BMMs純度。檢測TAK1抑制劑在不同濃度下對AGEs培養巨噬細胞活力的影響，激光共聚焦顯微鏡和流式細胞術檢測巨噬細胞M1亞型；RT-PCR檢測各組細胞中MCP-1與TNF-α mRNA的表達；Western blot法檢測TAK1、MAPK及NF-κB通路蛋白的表達。結果 AGEs刺激能增加M1型巨噬細胞百分比，TAK1抑制劑可抑制AGEs誘導下巨噬細胞向M1表型活化；與正常對照組比較，AGEs刺激不僅上調BMMs中MCP-1、TNF-α mRNA的表達（P＜0.01），而且p-TAK1、TAB1、p-JNK、p-p38MAPK、NF-κBp65蛋白表達也明顯增加（P＜0.05）；通過TAK1抑制劑下調p-TAK1表達的同時AGEs培養BMMs的TAB1、p-JNK、p-p38MAPK、NF-κBp65及TNF-α、MCP-1表達均明顯降低（P＜0.05）。結論 AGEs能誘導BMMs向M1表型活化，TAK1抑制劑可能通過TAK1/MAPKs、MAPKs/NF-κB途徑抑制AGEs對巨噬細胞的激活和炎癥因子的表達。

AGEs；TAK1；MAPK；NF-κB；巨噬細胞；炎癥

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是一種巨噬細胞激活介導的慢性炎癥性疾病［1－2］。在糖尿病的高糖環境中，體內游離氨基之間發生非酶促糖基化反應，最終生成晚期糖基化終末產物（AGEs）。研究表明，AGEs的聚集增加可誘發巨噬細胞的活化，是導致DN發生發展的重要原因。轉化生長因子β激活激酶1（TAK1）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是細胞絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號通路上游炎癥和免疫信號途徑的共同關鍵調節子［3］。有研究表明，MAPK和NF-κB信號通路是參與巨噬細胞激活的細胞內信號轉導途徑［4－5］。但是TAK1是否參與AGEs誘導巨噬細胞活化及其機制研究，目前尚未見報道，本實驗以BMMs為研究對象，體外模擬糖尿病腎病病理狀態，觀察TAK1抑制劑對BMMs中相關信號通路蛋白及炎癥因子的影響，探討TAK1信號通路在AGEs誘導巨噬細胞激活中的具體機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級♂C57BLKS/J小鼠24只，同窩清潔級♂野生對照小鼠12只，6～8周齡，體質量30～40 g，南京大學動物模式中心，動物合格證號：SCKX（蘇）2010-0001。

1.2 藥品與試劑 AGEs、牛血清白蛋白（BSA）（北京博奧森生物技術公司），胎牛血清（FBS），RPMI 1640（加拿大WISENT公司），小鼠成纖維細胞L929（中科院上海細胞庫），5Z-7-oxozeaenol（美國EMD Billerica公司），抗鼠F4/80抗體，抗鼠/人CD11b抗體，抗鼠CD11c抗體（美國Bio Legend公司），TR-Izol試劑（美國Life Technology公司），熒光定量試劑盒（美國Bio-Rad公司），RT-PCR引物（上海，生工），兔抗p-TAK1多克隆抗體、兔抗TAK1多克隆抗體、兔抗TAB1多克隆抗體、鼠抗ED-1單克隆抗體（美國Abcam公司）、小鼠抗p-p38MAPK單克隆抗體、兔抗p38MAPK多克隆抗體、兔抗NF-κB p65多克隆抗體（美國Cell Signaling公司）、兔抗MCP-1多克隆抗體、兔抗TNF-α多克隆抗體、小鼠抗β-ac-tin單克隆抗體、辣根酶標記羊抗兔IgG、辣根酶標記羊抗小鼠IgG（武漢三鷹生物技術公司）

2 方法

2.1 骨髓來源巨噬細胞提取 C57小鼠麻醉后頸椎脫臼處死，分離并剪斷股骨及脛骨的兩端，用含2％FBS的冷PBS沖洗出骨髓，過篩離心后加入紅細胞裂解液，冰上孵育10min；再以4℃離心5 min；棄上清，使用RPMI 1640培養基＋15％L929上清＋10％FBS＋雙抗培養基重懸細胞后計數，細胞濃度調整至1×109cells·L－1接種到6孔板，于5％ CO2，37℃孵箱中培養。7 d后，0.25％胰酶消化并收集非貼壁細胞。

2.2 流式細胞術分析BMMs純度 無血清培養基同步化BMMs 24 h，200 mg·L－1AGEs刺激24 h后收集［6］，經離心洗滌，加入抗小鼠CD16/32Fcγ受體20min阻斷細胞膜上Fc受體；再加入FITC標記的F4/80抗體，APC標記的CD11b和PE標記的CD11c，避光室溫孵育30 min，離心洗滌2次，重懸于500 μL PBS中，使用美國BD FACS Calibur流式細胞儀分別檢測F4/80、CD11b和CD11c陽性細胞百分比。

2.3 抑制劑對巨噬細胞活力影響 按照CCK-8 （cell counting kit）細胞毒性試劑盒說明書進行，取BBMs對數期生長細胞（每孔1×104）接種于96孔板，同步化培育24 h，分別加入不同濃度（10～1 000 nmol·L－1）的TAK1抑制劑或DMSO（對照組），37℃孵育1 h后，AGEs干預24 h；每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h；用酶標儀測490 nm處各孔吸光度，重復3次，計算平均細胞活力。

2.4 實時熒光定量PCR檢測各組巨噬細胞的MCP-1及TNF-α mRNA的表達 選TAK1抑制劑濃度30、100及300 nmol·L－1，作用于AGEs刺激的BBMs，分別加入1 mL TRIzol試劑，提取總RNA，進行RNA純度和濃度鑒定，使OD260/OD280在1.8～2.0之間；將RNA通過反轉錄系統A3500逆轉錄成cDNA，采用SYBR Green PCR試劑盒進行PCR測定。GAPDH：上游序列5′-GGTGAAGGTCG GTGTGAACG-3′，下游序列5′-CTCGCTCCTG-GAAGATGGTG-3′；TNF-α：上游序列5′-GCT-GAGCTCAAACCCTGGTA-3′，下游序列5′-CG-GACTCCG CAAAGTCTAAG-3′；MCP-1：上游序列5′-TTGACCCGTAAATCTGAAG CTAAT-3′，下游序列5′-TCACAGTCCGAGTCACACTAGTTCAC-3′。每個樣本設3個復孔，取均值，獲得平均Ct值，以GAPDH作為內參照校正，用2－△△Ct法分析基因的相對表達。

2.5 巨噬細胞實驗分組 通過預實驗摸索最佳抑制劑濃度為300 nmol·L－1，及各組蛋白表達最佳時間點。細胞培養至70％～80％融合時，同步化24 h，進行細胞分組：正常對照組（normal control，NC，RPMI 1640培養基）；BSA組（200 mg·L－1BSA，BSA）；AGEs組（200 mg·L－1AGEs，AGEs）；AGEs ＋OZ組（200 mg·L－1AGEs＋OZ300）。

2.6 激光共聚焦顯微鏡分析 將BMMs以1×105/孔的密度接種在玻璃皿底，4％多聚甲醛4℃下固定10 min，5％驢血清白蛋白阻斷2 h，加入抗iNOS抗體4℃孵育過夜。PBST洗3次后，加入Alexa Fluor 647標記的F4/80和FITC標記的二抗避光孵育2 h，DAPI染核，漂洗封片后，在德國Leica TCS SP5激光共聚焦顯微鏡下觀察采像。

2.7 Western blot檢測各組的蛋白表達 AGEs刺激同步化后的巨噬細胞，相應的時間點收集蛋白；并將蛋白電轉移至NC膜，使用麗春紅染色判斷有無條帶，將NC膜取出并置于TBST配制的5％脫脂奶粉于37℃封閉2 h；加入p-TAK1抗體（1∶1 000）、TAK1（1∶1 000）、TAB1（1∶1 000）、pJNK（1∶1 000）、JNK（1∶2 000）、p-p38MAPK（1∶1 000）、p38MAPK（1∶2 000）、NF-κBp65（1∶1 000）、β-actin抗體（1∶2 000）、4℃過夜；洗膜后加入用TBST稀釋的辣根酶過氧化物標記的羊抗兔IgG（1∶2 000），37℃孵育45 min；洗膜3次后使用ECL反應30 s，在Tanon 4500SF成像系統中顯影。用Tanon公司Lab-Works 4.5軟件對Western blot條帶進行半定量分析。以β-actin作為內參照，所有的結果至少重復3次。

3 結果

3.1 骨髓來源巨噬細胞純度鑒定 L929細胞上清液中含巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF），加入小鼠骨髓來源干細胞，d 7時，誘導成BMMs，經流式細胞儀檢測巨噬細胞表面標記物F4/80和CD11b，雙標陽性率達到99.35％（Fig 1）。

Fig 1 Purity detection of bone marrow derived macrophages

3.2 5Z-7-oxozeaenol對巨噬細胞活性的影響 選取10 nmol·L－1到1 000 nmol·L－1之間5種抑制劑濃度，Fig 2表明5Z-7-oxozeaenol濃度在10～300 nmol·L－1對AGEs刺激的BMMs活性無影響（P＞0.05），5Z-7-oxozeaenol 1 000 nmol·L－1時對AGEs刺激的BMMs活性有影響（P＜0.05）。

Fig 2 Viability analysis of BMMs after treatment with 5Z-7-oxozeaenol（10～1 000 nmol·L－1）in AGEs-induced BMMs

3.3 各組巨噬細胞MCP-1和TNF-α的mRNA表達 RT-PCR結果顯示，與對照組比較，AGEs刺激組BMMs MCP-1和TNF-α的mRNA表達明顯上調（P＜0.01），這一結果表明AGEs可以增加巨噬細胞炎癥因子的產生；隨5Z-7-oxozeaenol濃度（30、100、300 nmol·L－1）的升高，MCP-1、TNF-α mRNA表達呈下降趨勢，其中300 nmol·L－1的5Z-7-oxoze-aenol對炎癥因子抑制作用最強（P＜0.01），故5Z-7-oxozeaenol可以降低AGEs誘導的BMMs炎癥因子的表達，見Fig 3。

3.4 AGEs對巨噬細胞的活化及5Z-7-oxozeaenol的抑制作用 Fig 4A系激光共聚焦顯微鏡分析結果，提示AGEs組iNOS熒光強度明顯高于對照組，AGEs＋OZ300組iNOS熒光強度明顯減弱；但F4/80在所有組別的BMMs上均表達。流式細胞術顯示，AGEs組的F4/80、CD11b和CD11c三標的M1型巨噬細胞百分比較對照組明顯升高（P＜0.01），說明AGEs刺激可成功誘導BMMs功能表型向M1型活化；AGEs＋OZ300組M1型巨噬細胞百分比明顯降低（P＜0.01），提示5Z-7-oxozeaenol可抑制AGEs對巨噬細胞的活化作用，見Fig 4B。

3.5 各組巨噬細胞p-TAK1、p-JNK、p-p38MAPK、TAB1、NF-κB p65的蛋白表達 Western blot印跡條帶分析顯示AGEs組p-TAK1、p-JNK、p-p38MAPK、TAB1和NF-κB p65蛋白表達較對照組增加（P＜0.05），5Z-7-oxozeaenol干預可使巨噬細胞上述蛋白表達與AGEs組相比下降（P＜0.05），見Fig 5。

Fig 3 Real time PCR analyses effects of OZ on MCP-1 and TNF-α mRNA expression of BMMs under AGEs

4 討論

巨噬細胞的活化和浸潤是DN炎癥反應的特征性表現之一。經典激活型（classically activated，M1型）巨噬細胞是促炎及促纖維化的巨噬細胞表型，在早期炎癥反應階段，浸潤的巨噬細胞通過分泌IL-12、IL-23、TNF-α、IL-1β、活性氧（ROS），誘導型一氧化氮合酶（iNOS）及MCP-1等促炎因子引起的腎臟組織結構的損傷和破壞，參與DN間質炎癥反應及腎小球纖維化的發生［7］。糖尿病環境下生成的AGEs可以通過與細胞表面特異性受體結合，激活氧化應激及MAPK、NF-κB等信號傳導途徑，誘導細胞因子的表達及細胞外基質的聚集，導致腎小球纖維化、炎性細胞浸潤和蛋白尿產生［8－10］。故巨噬細胞的活化和AGEs的聚集與DN發生發展有著密切的關系。本實驗采用AEGs孵育巨噬細胞24 h，模擬體外糖尿病腎病炎癥狀態。F4/80、CD11b表示巨噬細胞的成熟度，iNOS和CD11c在活化的巨噬細胞中高表達，可作為M1型巨噬細胞表面標志［11］。激光共聚焦顯示AGEs組上述M1型巨噬細胞表面標志的百分比明顯高于對照組，說明AGEs刺激可成功誘導BMMs向M1型巨噬細胞分化。作為免疫反應的主要效應細胞，M1型巨噬細胞產生多種炎性細胞因子，如TNF-α和IL-1β，TNF-α具有介導生長、炎癥、免疫調節等多方面生物學效應［12］。最近的一項研究顯示，在單核/巨噬細胞中，AGEs通過上調mRNA水平并釋放促炎細胞因子IL-1β和TNF-α，進而誘導人單核細胞表達單核細胞趨化因子-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1），它對單核巨噬細胞具有很強的趨化激活作用［12－14］。前期預實驗結果顯示，10、30、100及300 nmol·L－1的5Z-7-oxozeaenol對AGEs刺激的BMMs活性無影響，在安全劑量范圍內選用30、100及300 nmol· L－13種濃度作用于AGEs刺激的BMMs，RT-PCR法檢測炎癥因子TNF-α、MCP-1的表達，較AGEs組均有降低（P＜0.05），其中300 nmol·L－1時的炎癥因子的表達最弱（P＜0.01），故后期的實驗分組中5Z-7-oxozeaeno的濃度選為300 nmol·L－1，而AGEs ＋OZ300組M1型巨噬細胞表面標志較AGEs組明顯降低（P＜0.01），提示5Z-7-oxozeaenol可抑制AGEs刺激的巨噬細胞的活化及TNF-α和MCP-1的產生，但具體的分子機制尚不清楚。

Fig 4 Effects of 5Z-7-oxozeaenol on macrophage activation in AGEs-induced BMMs

Fig 5 Effects of OZ on p-TAK1，TAB1，p-JNK，p-p38MAPK protein in AGEs-induced BMMs analysed by Western blot

TAKl為蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶，在序列與功能上屬于絲裂原激活蛋白激酶家族成員。TAK1作為調節多種促炎因子信號轉導通路，在促炎因子，如TNF-α、IL-1β、TGF-β、Toll樣受體（TLR）配體的參與下，首先通過激活MAP2Ks家族的MEK3/6和MEK4/7，然后MEK3/6和MEK4/7信號分別激活MAPK家族的應激活化激酶（JNK）、p38MAPK激酶進而激活轉錄因子激活蛋白1（AP-1）［15］。TAK1又可以通過與結合蛋白TAB1的共表達而被激活，磷酸化修飾被認為是TAK1依賴的信號轉導過程中重要調節機制［16］。NF-κB是轉錄因子家族中的成員，被AGEs產生的ROS激活，與靶基因上特定的DNA序列結合并調節基因轉錄，產生和釋放各種細胞因子，如MCP-1及TNF-α等，后者可進一步增加ROS的產生，二者形成級聯反應，構成惡性循環，導致NF-κB活性持續升高［17－18］。Hofmann等［19］的研究發現，DN患者外周血單個核細胞NF-κB的活性較DM患者明顯增強，并與蛋白尿程度相關，表明NF-κB活性與DN的發生及其程度密切相關。在UUO致腎小管間質纖維化小鼠模型中，JNK、p38MAPK、NF-κB信號通路在腎臟組織被激活以及下游的炎癥因子IL-1α、TNF-α、NOS2和CCL2mRNA表達增加，同時巨噬細胞浸潤明顯增加。利用基因敲除技術使UUO小鼠模型TAK1基因敲除，結果JNK、p38MAPK、NF-κB信號通路被抑制，炎癥因子的釋放減少以及巨噬細胞的浸潤明顯降低［8］。體內研究表明，TAK1抑制劑可以阻止損傷導致的TAK1和NF-κBp65的磷酸化［20］，TAK1基因敲出小鼠細胞的TNFR1、IL-1R和TLR3通路功能缺陷，下游信號NF-κB、JNK和IKKβ不能被激活［21］。因此，TAK1基因在調節JNK、p38MAPK和NF-κB通路及其下游炎癥因子的表達上發揮重要作用。本實驗通過Western blot法探討TAK1抑制劑對BMMs中TAK1、MAPK 和NF-κB信號通路的影響，與對照組相比較，AGEs組的p-TAK1、TAB1表達明顯升高，同時JNK、p38MAPK及NF-κB的磷酸化水平均增加，給予300 nmol·L－1TAK1抑制劑治療后，上述信號通路蛋白的表達均降低，說明TAK1通過磷酸化介導在調節MAPK及NF-κB信號通路中發揮至關重要的作用。

綜上所述，本研究模擬體外糖尿病病理環境，AGEs可以激活巨噬細胞中TAK1、MAPK及NF-κB信號通路，初步證實TAK1抑制劑可以干預巨噬細胞MAPK及NF-κB信號轉導通路的活化以及炎癥因子TNF-α、MCP-1的表達，從而抑制糖尿病炎癥反應，且為臨床上控制糖尿病炎癥的激活提供理論基礎。但是TAK1、MAPK及NF-κB信號通路之間是否存在相互作用，以及腎臟巨噬細胞分離進一步驗證TAK1在糖尿病腎病中的作用機制需要進一步的探討。

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Effect of TGF-β activated kinase-1 inhibitor on bone marrow-derived macrophages activation and its mechanism

FU Xin，XU Xing-xin，SHAO Yun-xia，FENG Shi-yao，LI Yuan-yuan，WU Yong-gui
（Dept of Nephrology，the First Affiliated Hospital，Anhui Medical University，Hefei 230022，China）

Aim We used bone marrow-derived macro-phages（BMMs），to explore the mechanism of macro-phage activation and the effect of TGF-β activated ki-nase-1（TAK1）inhibitor 5Z-7-oxozeaenol on it under AGEs conditions.Methods The BMMs were obtained from C57 mice，and purity of BMMs was detected by flow cytometry.Cell viability was tested after treatment with different concentrations of TAK1 inhibitors.Laser confocal microscopy was used to detect macrophage M1 subtype.Flow cytometry was used to analyse the macro-phage activated by AGEs.TNF-α and MCP-1 mRNA levels were evaluated by qRT-PCR.Western blot was used to detect the expression levels of TAK1 signal pathway protein.Results AGEs stimulation could in-crese the activity of M1 macrophages，and 5Z-7-oxoze-aenol could inhibit the differentiation of BMMs.Com-pared with control group，AGEs increased the expres-sion of MCP-1 and TNF-α mRNA（P＜0.01）.p-TAK1，TAB1，p-JNK，p-p38MAPK and NF-κBp65 proteins ex-pression also increased significantly（P＜0.05）.After treatment with inhibitor，transcription levels of MCP-1 and TNF-α decreased significantly（P＜0.05，P＜0.01）.5Z-7-oxozeaenol treatment downregulated the expression of p-TAK1，TAB1，p-JNK，p-p38MAPK and NF-κBp65 proteins（P＜0.05）.Conclusions AGEs can induce BMMs to M1 phenotypic polarization.5Z-7-oxozeaenol reduces the expression of inflammatory cyto-kine via inhibiting TAK1/MAPKs，MAPKs/NF-κB pathways.

advanced glycation end products；TAK1；MAPK；NF-κB；macrophage；inflammation

時間：2016－2－26 10：20 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.024.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.012

A

1001－1978（2016）03－0355－07

R-332；R329.24；R329.25；R345.57；R364.5；R692.39

2015－08－31，

2015－11－06

國家自然科學基金資助項目（No 81270813）

付 欣（1990－），女，碩士生，研究方向：糖尿病腎病分子機制研究與干預，Tel：0551-62922111，E-mail：fuxin729＠163.com；吳永貴（1966－），男，博士，教授，博士生導師，研究方向：糖尿病腎病分子機制研究與干預，Tel：0551-62922111，E-mail：wuyonggui＠medmail.com.cn