大黃酸對馬兜鈴酸A引起的斑馬魚腎臟損傷的保護作用

王 雪，劉可春，王希敏，韓利文，張姍姍，何秋霞，陳錫強，韓 建，王榮春

（山東省科學院生物研究所，山東省科學院斑馬魚藥物篩選平臺，山東省生物傳感器重點實驗室，山東濟南 250014）

大黃酸對馬兜鈴酸A引起的斑馬魚腎臟損傷的保護作用

王 雪，劉可春，王希敏，韓利文，張姍姍，何秋霞，陳錫強，韓 建，王榮春

（山東省科學院生物研究所，山東省科學院斑馬魚藥物篩選平臺，山東省生物傳感器重點實驗室，山東濟南 250014）

目的 觀察大黃酸在馬兜鈴酸A引起的斑馬魚腎臟損傷中的作用。方法 將腎臟發育完成的斑馬魚仔魚（4dpf）用馬兜鈴酸A處理24 h，造成馬兜鈴酸腎病模型，同時加入大黃酸處理，然后觀察仔魚的表型變化情況，并用肌酐檢測試劑盒測定仔魚組織中的肌酐含量，利用qPCR對仔魚組織中的炎性相關因子（cox2a）和致纖維化因子（TGFβ-1）進行定量檢測。結果 馬兜鈴酸A處理24h后，部分仔魚出現眼周水腫及血循環系統異常，表現為心跳微弱，心腔縮小，血流緩慢甚至停滯，發生率具有劑量相關性，馬兜鈴酸處理組仔魚組織中的肌酐含量比對照組明顯升高，cox2a和TGFβ-1表達量也比對照組明顯上升，同時加入大黃酸能降低異常仔魚所占比例，降低組織肌酐含量，并下調cox2a的表達，但對馬兜鈴酸引起的TGFβ-1的上升無影響。結論

大黃酸對馬兜鈴酸引起的斑馬魚腎臟損傷有一定的保護作用。

馬兜鈴酸；斑馬魚；仔魚；腎臟；大黃酸；肌酐

大黃酸（rhein，Rhe）屬單蒽核類1，8-二羥基蒽醌衍生物，是大黃、何首烏、虎杖等多種中藥的主要有效成分之一，藥理作用廣泛。在糖尿病腎病大鼠，大黃酸能下調血清中IL-1β、IL-12和TNF-α等細胞因子的濃度，減輕炎癥反應，減少糖尿病腎病大鼠尿蛋白泄漏，改善血脂異常，在糖尿病腎病各期發揮多靶點、多層次的治療作用［1］。大黃酸對腎臟纖維化形成的多個環節有治療作用。病理狀態下，以轉化生長因子TGF-β1為主導的細胞因子網絡激活成纖維細胞為肌成纖維細胞，并能將許多腎臟固有細胞如腎小管上皮細胞、內皮細胞等轉化為肌成纖維細胞，導致腎臟纖維化發生。大黃酸能抑制促纖維化因子TGF-β1的表達，阻止間質成纖維細胞的激活，阻斷腎間質的纖維化進程，在多種腎臟疾病中發揮腎保護作用［2］。在亞慢性鎘染毒小鼠，大黃酸對肝臟及腎損傷表現出一定的保護作用［3］。

馬兜鈴酸（aristolochic acid，AA）對多種動物種屬具有腎毒性，主要損傷腎小管上皮細胞，導致腎間質纖維化及腎萎縮，并出現低分子蛋白尿、嚴重貧血癥狀，被稱為“馬兜鈴酸腎病”。實驗中用馬兜鈴酸處理發育早期的斑馬魚，會引起仔魚水腫和腎臟形態功能異常，引起不可逆性腎臟損傷并終至仔魚死亡［4］。目前，臨床上對“馬兜鈴酸腎病”僅以預防為主，尚未找到有效的治療藥物和方法。本研究在利用馬兜鈴酸A進行染毒處理造成斑馬魚腎臟損傷的基礎上，加用大黃酸進行干預，通過檢測腎臟功能相關指標的變化，研究大黃酸在馬兜鈴酸腎病中的作用，并為利用斑馬魚模型篩選具有潛在治療腎臟損傷活性的化合物提供方法和思路。

1 材料

1.1 實驗動物 實驗所用為AB系野生型斑馬魚，在水溫28.5℃，保持14 h光照/10 h黑暗光照周期條件下養殖，每日于9：00 am和3：00 pm喂食兩次顆粒飼料。排卵前日將♀♂斑馬魚成魚按2∶1放入具篩板的產卵缸內，中間放置隔板，次日亮燈前抽去隔板，在光照刺激下排卵后，收集魚卵，用培養水沖洗3遍，然后放入新培養水中，在28.5℃，相同光照條件下發育至4 d大小。

1.2 試劑 馬兜鈴酸A（MW：341.27，純度≥99.0％）與大黃酸（MW：284.22，純度≥99.0％），均購自于中國食品藥品檢定研究院，分別用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解配制成儲液。TR-Izol試劑（美國Invitrogen公司），PrimeScriptTM1st Strand cDNA合成試劑盒（大連寶生物工程有限公司），iTaq Universal SYBR Green Supermix（美國Bio-Rad公司），Creatinine Assay kit ab65340與10 ku Spin Column ab93349（Abcam），其余試劑均為國產分析純。

胚胎培養水成分為：NaCl 5 mmol·L－1，KCl 0.17 mmol·L－1，CaCl20.4 mmol·L－1，MgSO40.16 mmol·L－1，用去離子水配制。

熒光定量PCR儀CFX96（美國Bio-Rad）；倒置顯微鏡IX51（日本Olympus），Spectra MR型酶標儀（美國Dynex），MICCRA D-1勻漿器（德國ART）

2 方法

2.1 斑馬魚分組與給藥 選用6孔細胞培養板進行實驗。吸取適量馬兜鈴酸A儲液至孔內，加入培養水進行稀釋，分別得到20 μmol·L－1和40 μmol ·L－1馬兜鈴酸A溶液作損傷組；向孔內同時加入馬兜鈴酸A與大黃酸儲液，用培養水稀釋得到含上述濃度馬兜鈴酸A與40 μmol·L－1大黃酸的混合液作為治療組；馬兜鈴酸A與大黃酸濃度由預實驗結果確定。向孔內加入含DMSO的培養水（DMSO含量≤0.5％V/V）作為溶劑對照組，小心混勻各孔溶液。隨機選取發育4dpf的斑馬魚仔魚，移入上面各孔溶液內，每孔中放置30尾仔魚，每孔同時做3個平行重復，然后放于恒溫控光培養箱內，孵育24 h。

處理結束后，在倒置顯微鏡下觀察各組仔魚形態，記錄仔魚異常情況并計數，拍照。

2.2 斑馬魚仔魚組織中肌酐含量檢測 肌酐是肌肉的代謝產物，由前體化合物磷酸肌酸轉化而成，正常情況下，每日產生的肌酐主要由腎小球濾過排出體外。肌酐的含量變化主要由腎臟濾過能力決定，腎功能受損時，肌酐在體內蓄積，含量升高。

實驗中收集各處理組與對照組中存活仔魚，用純凈水充分沖洗后，移入2 mL離心管，盡量吸凈水分，然后向每管加入500 μL去離子水，冰浴勻漿。將勻漿樣品加入10 ku Spin Column中，4℃，10 000 ×g，離心10min，除去樣品中的蛋白成分，收集濾液。然后按Creatinine Assay kit操作步驟，吸取濾液與肌酐反應液混合，37℃，反應1 h，于570 nm處讀取OD值。根據肌酐標準曲線回歸方程，計算各樣品中的肌酐含量，進一步計算得到各組斑馬魚仔魚組織中的肌酐含量。

2.3 qPCR檢測斑馬魚仔魚組織TGFβ-1、cox2a基因的表達量 馬兜鈴酸導致腎臟損害的重要特征是腎間質纖維化，同時伴有炎癥反應發生。在利用斑馬魚為模型進行馬兜鈴酸腎病研究中，已檢測到促炎性因子cox2a與致纖維化因子TGFβ-1表達量上升，說明TGFβ-1與cox2a這兩種因子的表達水平與馬兜鈴酸腎病發病機制及病程進展密切相關。

實驗中收集對照組和處理組的存活斑馬魚仔魚，用滅菌水沖洗后，分別加入TRIzol試劑提取仔魚組織的總RNA，逆轉錄成cDNA，取1 μL cDNA產物進行qPCR，檢測各組斑馬魚仔魚組織中TGFβ-1、cox2a基因的表達情況，以β-actin作為內參基因。qPCR反應體系為20 μL，反應條件為：95℃30 s，95℃5 s，60℃40 s，40個循環。采用2－△△Cq法分析基因的相對表達量：△Cq（處理組）＝Cq（處理組目的基因）－Cq（對照組內參基因），△Cq（對照組）＝Cq（對照組目的基因）－Cq（對照組內參基因），△△Cq＝△Cq（處理組）－△Cq（對照組），以2－△△Cq表示處理組目的基因的表達倍數。

β-actin：forward 5′AGAGCTATGAGCTGCCT-GACG 3′；reverse 5′CCGCAAGATTCCATACCCA 3′；cox2a：forward 5′ATCCTGTTGTCAAGGTCCCA 3′；re-verse 5′CAAGGGTGCGGGTGTAAT 3′；TGFβ-1：for-ward 5′GAACTCGCTTTGTCTCCA 3′；reverse 5′TACAGTCGCAGTATAACCTCA 3′。

2.4 統計學分析 采用SPSS 13.0對實驗數據進行分析，各組均值用±s表示，采用獨立樣本t檢驗法比較組間差異的顯著性。

3 結果

3.1 不同處理組斑馬魚仔魚的表型與存活情況發育4 dpf的斑馬魚仔魚經馬兜鈴酸A處理24 h后，部分仔魚出現明顯的眼周水腫表現，發生率與馬兜鈴酸A濃度呈相關性。當馬兜鈴酸A濃度升高至40μmol·L－1時，除眼周水腫外，斑馬魚仔魚的血循環系統也出現中毒癥狀，表現為心跳微弱、心腔縮小，血流緩慢甚至停滯（Fig 1），仔魚的活動能力明顯降低。用40 μmol·L－1大黃酸與馬兜鈴酸A同時對斑馬魚仔魚進行處理，24 h后，出現上述異常的仔魚比例較損傷組均有顯著降低。處理時間為24 h時，各處理組仔魚的死亡率與對照組比較差異無顯著性（Tab 1）。

3.2 斑馬魚仔魚組織中肌酐含量 在發育5 dpf時，正常對照組斑馬魚仔魚組織中的肌酐含量值為每50尾（153.51±7.1）nmoL。4 dpf的斑馬魚仔魚經馬兜鈴酸A（20 μmol·L－1）和大黃酸（40 μmol· L－1）處理24 h后，損傷組與治療組仔魚組織中肌酐含量值與對照組相比無明顯變化。在40 μmol· L－1馬兜鈴酸A處理組，斑馬魚仔魚組織肌酐含量值升高至每50尾（183.30±8.2）nmoL，高于對照組，差異有顯著性。大黃酸治療組仔魚組織肌酐值為每50尾（159.23±5.6）nmoL，比損傷組有明顯降低。

Tab 1 Defective phenotypes and mortality of zebrafish larvae after exposure to aristolochic acid and rhein

Fig 1 Phenotypes of zebrafish larvae after aristolochic acid treatment

Fig 2 Creatinine value in zebrafish larvae of different treatment groups

3.3 斑馬魚仔魚TGFβ-1、cox2a基因的表達 經20 μmol·L－1馬兜鈴酸A處理24 h后，斑馬魚仔魚組織中cox2a表達水平為對照組的（4.43±0.475）倍，差異有顯著性，同時加入大黃酸能明顯降低cox2a表達水平，但與對照組相比，仍有明顯升高。在馬兜鈴酸A濃度為20 μmol·L－1時，損傷組與大黃酸治療組TGFβ-1的表達量與對照組均無明顯差異。馬兜鈴酸A濃度為40 μmol·L－1時，處理24 h后，仔魚組織中cox2a、TGFβ-1的表達量比對照組均有明顯升高，分別為對照組的（9.55±0.407）和（1.59±0.074）倍，大黃酸治療組cox2a的表達仍保持在較高水平，與損傷組差異無顯著性。見Fig 3。

4 討論

目前已知，服用含馬兜鈴酸成分的中藥材會嚴重損害腎臟功能，并導致腎臟癌變發生。馬兜鈴酸引起腎臟損傷的機制隨劑量不同而有差別，在大劑量下，馬兜鈴酸直接引起腎小管上皮細胞急性壞死，進而發生腎間質纖維化；長期小劑量攝入時，馬兜鈴酸與細胞DNA形成AA-DNA加合物，引起DNA斷裂，導致腎小管損傷和腎間質纖維化。實驗中發現，用馬兜鈴酸處理發育早期的斑馬魚胚胎，會引起胚胎腎臟形態發育異常和腎臟功能受損［4］。斑馬魚發育周期短，受精72 hpf時，腎臟發育已經完成，具備成熟的濾過排泄功能。在胚胎期，斑馬魚腎臟在進化階段上屬于前腎，前腎結構相對簡單，僅由一對腎單位組成，但在分子水平和生物功能上與哺乳動物類相似，是進行化合物腎臟毒性研究的理想模型。

Fig 3 Expression levels of TGFβ-1 and cox2a genes in zebrafish larvae of different treatment groups

本實驗中，發育4dpf的斑馬魚仔魚經馬兜鈴酸A處理24 h后，仔魚出現明顯的眼周水腫。水腫是腎臟疾病患者的常見癥狀，是由于腎功能受損致使水分無法排出，潴留在組織間隙引起。已有實驗發現，在腎臟功能發生損傷時，斑馬魚也會出現局部或全身水腫表現。在Zhou等［5］實驗中，用甲硝唑處理Tg（pod：：NTR-mCherry）斑馬魚，誘導腎臟足細胞發生凋亡，導致腎臟功能受損后，胚胎出現明顯的眼周水腫表現。但另一方面，在基于斑馬魚模型進行的化合物毒性實驗中，水腫是一種較為常見的表型改變，可繼發于多種器官毒性損傷，而非腎臟損傷特異。為進一步確認腎臟損傷情況，實驗中選取了與腎臟功能相關的特異指標進行檢測。肌酐是肌肉組織的代謝產物，每日產生的肌酐均由腎臟排出體外，腎臟功能受損時，肌酐在體內蓄積。在臨床上，檢測血肌酐值是診斷腎臟疾病的常用手段。由于斑馬魚仔魚體積小，不易獲取血液樣本，本實驗中對仔魚組織中的肌酐進行提取檢測。結果發現，在40 μmol ·L－1馬兜鈴酸A處理組，斑馬魚仔魚組織中肌酐含量值較正常組有明顯提高，說明仔魚的腎臟功能受到損害，肌酐排泄受阻，致使肌酐在體內出現蓄積。

作為多種中藥材的有效成分之一，大黃酸具有抗炎、降低纖維化等藥理活性，能降低糖尿病腎病鼠的尿蛋白水平，減輕腎臟肥大。為觀察大黃酸對斑馬魚馬兜鈴酸腎病中的保護作用，在本實驗中，在用馬兜鈴酸A處理造成腎臟損傷的同時加入大黃酸作為治療組，結果發現，治療組仔魚眼周水腫和血循環系統異常的發生率較相應損傷組均有明顯降低，同時，大黃酸能降低馬兜鈴酸A處理組仔魚組織的肌酐值，說明大黃酸在馬兜鈴酸所致的腎臟損傷中具有腎臟保護作用。馬兜鈴酸導致腎臟損害的一個重要特征是腎間質發生纖維化，同時伴有炎癥反應的發生，因此，本實驗中對各組仔魚組織的炎性相關因子cox2a和致纖維化因子TGF-β1的基因表達量進行了檢測。發現馬兜鈴酸A處理組cox2a和TGF-β1基因的表達水平較對照組有明顯升高，并具有劑量相關性。在馬兜鈴酸A低濃度（20 μmol· L－1）處理組，合并加入大黃酸后能明顯降低cox2a的表達水平，但在馬兜鈴酸A高濃度（40 μmol· L－1）組，大黃酸對cox2a表達量的影響并不明顯，損傷組與治療組cox2a的表達水平均明顯高于對照組。以往在糖尿病腎病大鼠模型中觀察到大黃酸能夠下調TGF-β1表達水平，抑制腎小管上皮細胞的轉分化，阻止纖維化發生。但本實驗結果顯示，在馬兜鈴酸引起的腎臟損傷中大黃酸對TGF-β1的表達水平幾乎沒有影響。蘇健等［6］用慢性移植腎腎病（CAN）大鼠模型研究大黃酸對抗纖維化因子的影響，發現隨著CAN病程的進展，腎組織TGF-β1的表達明顯增加，加入大黃酸未影響CAN進展過程中TGF-β1的表達。由此可見，在不同類型的腎臟疾病中，大黃酸對TGF-β1產生不同作用，這也提示我們，大黃酸對TGF-β1的下調及阻抑并不是其發揮抗纖維化活性的唯一機制。

綜上所述，在斑馬魚馬兜鈴酸腎病模型中，加入大黃酸進行處理，能減少異常發生率，降低仔魚組織中的肌酐含量，顯示出一定的腎臟保護作用。大黃酸安全性高、藥理活性廣泛，尤其在糖尿病腎病治療中的獨特療效已得到實驗驗證，目前國內已將單體大黃酸列為一類新藥進行重點研究，相信經過體內活性實驗及臨床療效確證，大黃酸將能在腎臟功能保護及腎臟損傷治療方面得到更為廣泛的應用。本實驗利用斑馬魚腎臟損傷模型評價化合物的活性，充分利用了斑馬魚產卵量大、發育周期短的優勢，可以快速篩選獲得具有腎臟保護作用的活性成分，極大提高了新藥發現和研發效率。

（致謝：本實驗全部于山東省科學院生物研究所藥物篩選研究室完成，在此表示衷心感謝！）

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Protective effect of rhein on aristolochic acid-induced renal injury in zebrafish

WANG Xue，LIU Ke-chun，WANG Xi-min，HAN Li-wen，ZHANG Shan-shan，HE Qiu-xia，CHEN Xi-qiang，HAN Jian，WANG Rong-chun
（Biology Institute of Shandong Academy of Sciences，Zebrafish Drug Screening Platform of Shandong Academy of Sciences，Key Laboratory for Biosensors of Shandong Province，Jinan 250014，China）

Aim To study the effect of rhein on renal damage induced by aristolochic acid.Methods Ze-brafish model of aristolochic acid nephropathy，genera-ted by treating zebrafish larvae with aristolochic acid for 24 h，was treated with rhein simultaneously.Mor-pholigical changes were observed and the creatinine level in larvae tissue was measured.And mRNA ex-pression levels of inflammatory factor cox2a and fibrosis factor TGF-β1 in larvae tissue were detected using qPCR.Results Some larvae show periocular edema and circulation system defection e.g.weak heart beat，narrow cardiac vesicle，decreased blood flow and even blockage，with a dose-response relationship after expo-sure to aristolochic acid for 24 h.The creatinine level in larvae tissue of the treated group was significantly higher than that of the control larvae.And the expres-sion levels of cox2a and TGF-β1 in larvae tissue of the treated group were also significantly increased.Per-centage of abnormal larvae and creatinine level in lar-vae tissue were decreased when treated with rhein sim-ultaneously.And the expression levels of cox2a was down-regulated by rhein compared with the aristolochic acid treated group.But rhein had no effect on TGF-β1 expression.Conclusion To some extent rhein can protect renal from damage induced by aristolochic acid.

aristolochic acid；zebrafish；larvae；kid-ney；rhein；creatinine

時間：2016－2－26 10：20 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.026.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.013

A

1001－1978（2016）03－0361－05

R-332；R284.1；R322.61；R692.01

2015－10－09，

2015－12－24

國家自然科學基金資助項目（No 81202584，31400979）；山東省自主創新重大專項（No 2014ZZCX0215）

王 雪（1978－），女，碩士，高級工程師，研究方向：藥物毒性評價及活性篩選，E-mail：wangxue8809＠163.com；劉可春（1964－），男，博士，研究員，通訊作者，Tel：0531-82605352，E-mail：hliukch＠sdas.org