燈盞細辛提取物中3種活性成分在Caco-2細胞模型吸收機制的研究

胡 杰，侯 佳，李月婷，王愛民，2，黃 勇

（貴州醫科大學1.貴州省藥物制劑重點實驗室，2.民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，3.藥學院，貴州貴陽 550004）

燈盞細辛提取物中3種活性成分在Caco-2細胞模型吸收機制的研究

胡 杰1，3，侯 佳1，李月婷1，3，王愛民1，2，黃 勇1，3

（貴州醫科大學1.貴州省藥物制劑重點實驗室，2.民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，3.藥學院，貴州貴陽 550004）

目的 研究燈盞細辛提取物（erigeron breviscapus ex-tract，Ebe）中3種活性成分燈盞甲素、咖啡酸和綠原酸的吸收機制。方法 建立人結腸腺癌細胞系（the human colon carcinoma cell line，Caco-2細胞）模型；利用該模型研究Ebe的細胞攝取規律，通過UPLC-MS/MS法測定Caco-2細胞中燈盞甲素、咖啡酸和綠原酸的濃度，研究pH、時間以及藥物濃度對3種活性成分的轉運影響；考察在P-糖蛋白抑制劑（維拉帕米、環孢素A）存在與否時3種活性成分在Caco-2細胞模型中的轉運情況。結果 受試物Ebe在所設置的濃度范圍內（0.1～25.0 g·L－1）對Caco-2細胞無毒副作用。燈盞甲素和綠原酸在Caco-2細胞攝取實驗中具有濃度、時間依賴性，呈正相關，滲透系數維持在一個平衡狀態。咖啡酸具有濃度飽和性，且加入P-糖蛋白抑制劑后咖啡酸的細胞攝取量明顯增加。結論 Ebe中燈盞甲素和綠原酸主要表現為被動轉運，P-糖蛋白參與了咖啡酸的攝取過程，咖啡酸的吸收主要由載體媒介轉運實現。

吸收；燈盞細辛提取物；燈盞甲素；咖啡酸；綠原酸；Caco-2細胞；UPLC-MS/MS法；P-糖蛋白抑制劑

燈盞細辛是菊科植物短葶飛蓬Erigerm brevisca-pus（Vant.）Hand.-Mazz的干燥全草，主要分布于我國西南地區，具有散寒解表、活血化瘀、通經活絡、消炎止痛之功效。現代藥理研究表明：燈盞細辛具有抗血栓、抗缺血以及腦缺血/再灌注神經損傷保護作用。目前已從燈盞細辛中分離、鑒定出黃酮類化合物、咖啡酸酯類化合物、酚酸類化合物以及其它類化合物［1］。其中燈盞甲素、咖啡酸和綠原酸分別代表這三大類化合物，均具有抗氧化、清除自由基等腦保護作用，是燈盞細辛中的有效成分。燈盞甲素、咖啡酸和綠原酸的同時檢測能夠較好地代表燈盞細辛的整體效應，符合中藥研究整體觀念的新思路。Caco-2來源于人結腸腺癌細胞，其結構和生化作用類似人小腸上皮細胞。將Caco-2細胞模型作為中藥吸收研究的快速篩選工具，能夠在細胞水平上提供藥物分子吸收的綜合信息。因此本文采用Caco-2細胞模型，結合UPLC-MS/MS法研究燈盞細辛提取物（erigeron breviscapus extract，Ebe）中有效成分燈盞甲素、咖啡酸和綠原酸的吸收特征，以期為Ebe的口服制劑研究提供一定的科學依據，并為中藥體外吸收機制研究提供新思路［2－5］。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 葛根素（批號110752-200912）、綠原酸（批號L11-2013012）、咖啡酸（批號1163-091112）和燈盞甲素（批號1384-101215），以上對照品均購自中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心；燈盞細辛提取物自制（批號：20130615）；Hank’s緩沖溶液（HBSS，Gibco）；DMEM培養基（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，Gibco）；考馬斯亮藍（20140822，南京建成生物工程研究所）；胎牛血清（Fetalbovineseurm，Biochrom）；鏈霉素；胰蛋白酶（Trypsin，igma）；DMSO（北京Solarbio科技有限公司）；實驗用水為超純水。

1.2 儀器 ACQUITY系統超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀，包括二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、三重四級桿質量分析器和Masslynx4.1質譜工作站（美國Waters公司）；Allegra 64R高速離心機（美國Beckman Coulter公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設備總廠）；二氧化碳培養箱（Thermo scientif-ic）；ZH-2渦旋混合器（天津藥典標準儀器廠）；CQ 250A-TS超聲波清洗機（上海躍進醫用光學器械廠）；置相差顯微鏡（日本Olympus）；功能酶標儀（Thermo3001 VARIOSKAN FLASH）；TGL-16G離心機；Mill cell-ERS電位儀（美國Millipore公司）。

1.3 色譜條件 Waters Acquity BEH C18（2.1 mm ×50 mm，1.7 μm）色譜柱；0.1％甲酸乙腈－0.1％甲酸水梯度洗脫，梯度為0～3 min：5％～25％，3～4 min：25％～95％，4～5 min：5％；流速為0.35 mL ·min－1；柱溫：45℃。進樣體積為1 μL［6］。

1.4 質譜條件 Waters Acquity TQD質譜儀，Mass-LynxV4.1工作站，電噴霧電離源（ESI）；毛細管電壓：3kV；離子源溫度：120℃；去溶劑氣溫度：350℃；去溶劑氣為氮氣（650 L·h－1）；碰撞氣為氬氣（0.16 mL·min－1）［6］；掃描方式為多反應離子監測模式（MRM），用于定量的正離子對等質譜信息見Tab 1。

Tab 1 Mass spectrometric condition

1.5 標準溶液的配制 精密稱取綠原酸、咖啡酸和燈盞甲素適量，用甲醇定容至10 mL。獲得綠原酸（0.5004 g·L－1）、咖啡酸（0.497 g·L－1）和燈盞甲素（1.06 g·L－1）儲備液。分別精密量取綠原酸等3種對照品儲備液適量，用甲醇按梯度稀釋成所需濃度，得混合系列標準溶液。置冰箱（－20℃）保存，備用。

1.6 Caco-2細胞模型的建立 Caco-2細胞株，傳代數在50代之內。將細胞接種于培養瓶，培養液為高糖DMEM培養基，培養基中含10％胎牛血清（含3.7 g·L－1NaHCO3，1％L-谷氨酰胺以及105U· L－1青霉素、鏈霉素雙抗液）置于5％CO2，37℃培養箱中培養［2］。待細胞生長融合約80％貼壁時，采用0.25％胰蛋白酶消化，細胞按10×104個·cm－2接種于6孔培養板，接種24 h后更換培養液，以后隔天換培養液1次，1周后每天換液1次，細胞培養14 d后，細胞生長均勻、邊界清晰，成單層膜狀態，測定細胞跨膜電阻值為300 Ω·cm2以上，可用于攝取實驗［2］。

1.7 細胞裂解液的制備 將已培養好的Caco-2細胞用PBS緩沖液洗去其表面雜質。加入含藥的Hank’s溶液（考察藥物濃度對Caco-2細胞的影響時，此處加入不同濃度的Ebe Hank’s溶液）2 mL，置于37℃的培養箱中，分別考察不同培養時間、培養介質不同pH和P-糖蛋白抑制劑對Ebe細胞攝取的影響。在考察的培養時間取出后，加入4℃的PBS緩沖液洗去細胞表面藥液和雜質，加入0.1％ Triton X-100細胞裂解液500 μL，反復凍融裂解細胞，取出細胞超聲5 min，得細胞裂解液［2］。

1.8 樣品前處理方法 取轉運樣品（細胞裂解液或細胞混懸液）300 μL，加入10 μL葛根素內標和300 μL甲醇沉淀蛋白，渦混2 min，離心（4℃，15 000 r·min－1）10 min，分離上清液2 μL進樣分析。

2 結果

2.1 UPLC-MS/MS分析方法的確證 分別取空白細胞混懸液、混合標準溶液（內標為葛根素）以及進行攝取實驗的細胞樣品溶液，渦旋2 min，離心（15 000 r·min－1）10 min，分離出上清液進樣分析。在本實驗條件下，空白細胞混懸液中無雜質峰干擾，細胞混懸液中綠原酸，咖啡酸、燈盞甲素及內標葛根素分離完全，保留時間Rt分別為1.55、1.77、3.19、1.87 min。結果見Fig 1，圖中以時間為橫坐標，百分強度為縱坐標。

以混合溶液中的藥物濃度為橫坐標，樣品與內標的峰面積比為縱坐標，得到燈盞細辛提取物的工作曲線，其線性范圍、回歸方程如Tab 2所示。

Tab 2 Linear relationships of three components

選取Tab 2中2、4、6這3個濃度的標液，加入空白細胞混懸液中作為質量控制樣品（QC），分別進樣分析，將測定的濃度與加入的已知標液濃度比較，求得提取回收率為90.2％～105.8％。每一個濃度進行5樣本分析，連續測定3 d，日內精密度RSD％ 為0.11％～8.44％；日間精密度RSD％為0.11％～6.43％。上述質控樣品分別于室溫下保存1、2和 3 d后處理并測定，與零時測定結果比較，RSD％均＜15％。以上結果表明，該方法穩定、靈敏，重現性好。

Fig 1 Typical UPLC-MS/MS chromatograms

Fig 2 Study on toxicity of Ebe to Caco-2 cells（±s，n＝5）

2.2 不同濃度Ebe對Caco-2細胞毒性實驗 實驗分為對照組、藥物組。對照組每孔加入100 μL DMEM培養液；藥物組將藥物稀釋至不同體積比濃度：0.1、1、5、15、25 g·L－1，每孔加入100 μL。分別作用Caco-2細胞4 h后用MTT法檢測。該實驗每個濃度平行5孔，重復3次，結果見Fig 2，對照組與各給藥組間細胞生長情況差異無統計學意義，表明在所設置的濃度范圍內，隨著濃度的增加，Ebe對Caco-2細胞的生長無毒性作用，可以進行下一步攝取實驗。

2.3 濃度依賴性攝取實驗 取不同濃度的Ebe Hank’s溶液（0.3、1、2.5、4、5 g·L－1）2 mL（n＝3）加入Caco-2細胞中，于37℃條件培養60 min，考察不同濃度Ebe對細胞攝取的影響。結果見圖3，燈盞甲素和綠原酸的攝取量隨著Ebe溶液濃度的增加而緩慢增加；咖啡酸隨著Ebe溶液濃度的增加，先增加，后減少。

Fig 3 Effects of different concentrations of Ebe on uptake of Caco-2 cells（±s，n＝5）

2.4 時間對Caco-2細胞攝取的影響 將Ebe（4 g ·L－1）加入到培養好的細胞中，考察不同時間（15、 30、60、90、120、180 min）后Ebe中各成分作用被Ca-co-2細胞攝取的變化。結果見Fig 4，隨著攝取時間的延長，綠原酸和燈盞甲素的攝取量緩慢增加，而咖啡酸的攝取量呈遞減趨勢，可能受藥物外排轉運器的影響，使已攝取入胞內的部分咖啡酸排出細胞。

Fig 4 Effects of different time of Ebe on uptake of Caco-2 cells（±s，n＝5）

2.5 pH值對Caco-2細胞攝取的影響 將Ebe（4 g·L－1）分別溶于不同pH（4.0、6.0、7.4）Hank’s溶液中，在加藥培養60 min后測定不同pH值對Caco-2細胞攝取Ebe的影響。結果見Fig 5，燈盞甲素、綠原酸的細胞攝取量隨pH值增加而降低，咖啡酸的細胞攝取量隨pH值增加而明顯增加，表明Ebe中各成分的轉運依賴于pH，綜合各成分的吸收特征確定藥物吸收的最佳pH值有利于藥物的最大吸收。

Fig 5 Effects of different pH of Ebe on uptake of Caco-2 cells（±s，n＝5）

2.6 p-糖蛋白抑制劑對Caco-2細胞攝取的影響P-糖蛋白抑制劑維拉帕米（verapamil，50 mg·L－1）和環孢素A（cyclosporine A，10 mg·L－1）對Ebe中各成分轉運的影響見Tab 3。燈盞甲素和綠原酸的細胞攝取量與對照組相比差異均無顯著性（P＞0.05），表明燈盞甲素和綠原酸的攝取不受P-gp影響。而維拉帕米和環孢素A均能影響咖啡酸的攝取，P-糖蛋白抑制劑的參與使咖啡酸的攝取量明顯增加（P≤0.05）。

Tab 3 Effect of verapamil and cyclosporine A on uptake by Caco-2 cell monolayers（±s，n＝3）

Tab 3 Effect of verapamil and cyclosporine A on uptake by Caco-2 cell monolayers（±s，n＝3）

*P＜0.05 vs extract.

Composition Uptake/mg·g－1Pro Chlorogenic acid 0.11±0.03 Verapamil＋Chlorogenic acid 0.10±0.01 Cyclosporin A＋Chlorogenic acid 0.11±0 3，4-Dihydroxycinnamic acid 0.15±0.01 Verapamil＋3，4-Dihydroxycinnamic acid 0.19±0.02*CyclosporinA＋3，4-Dihydroxycinnamic acid 0.19±0.02*Apigenin-7-O-glucronide 9.46±2.59 Verapamil＋Apigenin-7-O-glucronide 9.52±2.11 CyclosporinA＋Apigenin-7-O-glucronide 10.03±0.87

3 討論

Caco-2細胞模型是目前國內外廣泛應用的體外吸收模型，已成為藥物吸收研究的快速篩選工具，并獲得美國FDA批準。該模型能夠在細胞水平上提供藥物透過小腸黏膜的吸收、轉運以及毒性的綜合信息。用Caco-2細胞模型可以分別研究藥物從AP側（apical side）的攝入和BL側（basolateral side）的外排過程，該模型能夠較好地闡明藥物在小腸中的吸收機制，而動物體內實驗則無法做到［7］。

Caco-2細胞的實驗結果表明，Ebe中各成分的轉運依賴于pH，且各成分吸收的最佳pH并不一致，綜合Ebe中各成分的吸收特征確定其吸收的最佳pH，將有助于該藥物制劑的設計。Ebe中咖啡酸的吸收具有飽和現象，其吸收機制可能為載體媒介轉運。進一步的實驗證明，維拉帕米和環孢素A的參與能夠明顯提高咖啡酸的吸收。因此，咖啡酸可能是P-糖蛋白的底物，其轉運機制是載體媒介轉運中的主動轉運。P-糖蛋白作為主要的藥物外排轉運器，能將其底物從漿膜側泵回黏膜側而進入腸腔排出，其結果可能會導致藥物透膜吸收減少，生物利用度降低。因此，對于某些可被P-糖蛋白識別并外排的藥物，通過抑制P-糖蛋白的表達可促進藥物吸收，提高其生物利用度［8－9］。

研究顯示，中藥防治疾病的物質基礎是多成分協同作用的綜合結果。因此，同時研究中藥中多個成分的吸收特征，將多成分整體性質擬合進行綜合分析，符合中藥研究整體觀念新思路。并且在中藥多成分研究中，有預見性地針對吸收性質不良或特殊的成分提出新的口服劑型方案，將對中藥口服劑型的現代化發展和走向世界起到重要作用［10］。

（致謝：本實驗在貴州省藥物制劑重點實驗室和民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心聯合完成。真誠感謝貴州省藥物制劑重點實驗室和民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心為本實驗開展提供相關實驗耗材與儀器設備。真誠感謝實驗室各位同事、老師在實驗中給予我的指導與幫助。）

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In vitro absorption mechanism of Erigeron breviscapus extract in Caco-2 cell monolayer model

HU Jie1，3，HOU Jia1，LI Yue-ting1，3，WANG Ai-min1，2，HUANG Yong1，3
（1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics；2.Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM（Ministry of Education）；3.School of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China）

Aim To study the absorption mechanism of apigenin-7-O-glucronide，3，4-Dihydroxycinnamic acid and chlorogenic acid in Erigeron breviscapus extract （Ebe）by Caco-2 cell monolayer model.Methods The three active ingredients were quantified by UPLC-MS/MS method，and the effect of Ebe concentrations，conveying times，pH values and P-glycoprotein inhibi-tor on the transport of three active ingredients were also investigated.Results Apigenin-7-O-glucronide and chlorogenic acid in Caco-2 cell monolayer model were time-dependent and concentration-dependent.The 3，4-Dihydroxycinnamic acid in Caco-2 cell uptake was concentration-saturate and P-glycoprotein inhibitor was involved in the uptake process.Conclusion The mechanism of apigenin-7-O-glucronide and chlorogenic acid absorption in cells is mainly through passive trans-port，and the absorption of 3，4-Dihydroxycinnamic acid is mainly realized by the carrier transport.

absorption；Erigeron breviscapus extract；apigenin-7-O-glucronide； 3，4-Dihydroxycinnamic acid；chlorogenic acid；Caco-2 cell；UPLC-MS/MS method；P-glycoprotein inhibitor

時間：2016－2－26 10：20 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.030.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.015

A

1001－1978（2016）03－0373－05

R284.1；R329.24；R977.6

2015－10－22，

2015－12－17

國家自然科學基金資助項目（No 81260636）；貴州省科學技術基金項目（No黔科合J字［2013］2035號）；貴州省高等學校創新能力提升計劃（No黔教合協同創新字No ［2013］04）；貴州省中藥現代化科技產業專項基金項目（No黔科合重G字［2013］4001）；貴州省中醫藥管理局項目（No QZYY-2015-080）

胡 杰（1991－），女，碩士生，E-mail：hujie51619＠sina.cn；黃 勇（1976－），男，博士，教授，研究方向：中藥活性成分及新藥開發，通訊作者，Tel/Fax：0851-86908899，E-mail：759843553＠qq.com