5-羥基-1-氫-吲唑?qū)H-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

徐圓圓，梁小鳳，朱雯婷，饒進(jìn)軍，王文雅

（1.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院臨床藥理研究所，廣東廣州 510515；2.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院藥劑科，廣西南寧 530003；3.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510515）

5-羥基-1-氫-吲唑?qū)H-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

徐圓圓1，梁小鳳2，朱雯婷3，饒進(jìn)軍1，王文雅1

（1.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院臨床藥理研究所，廣東廣州 510515；2.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院藥劑科，廣西南寧 530003；3.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510515）

目的 研究5-羥基-1-氫-吲唑?qū)?-甲基-4-苯基-吡啶離子（MPP＋）誘導(dǎo)凋亡的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。方法 以MPP＋誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡建立體外帕金森病細(xì)胞模型，以MTT法篩選藥物有效保護(hù)濃度；以免疫化學(xué)染色以及Hoechst 33258核染研究藥物的神經(jīng)保護(hù)作用以及抗凋亡作用；以Western blot法檢測(cè)與神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)的磷酸化tau蛋白及其上游激酶磷酸化糖原合成激酶（P-GSK-3β）和周期依賴(lài)性蛋白激酶5（cyclin dependent kinase，CDK5）的表達(dá)。結(jié)果 MPP＋可引起GSK-3β的活化以及CDK5活性升高，誘導(dǎo)tau的異常磷酸化和神經(jīng)細(xì)胞凋亡；而5-羥基-1-氫-吲唑可下調(diào)GSK-3β與CDK5的活性，降低磷酸化tau的水平和抑制MPP＋導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡。結(jié)論 5-羥基-1-氫-吲唑可抑制MPP＋引起的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制可能是通過(guò)同時(shí)抑制GSK-3β和CDK5兩條信號(hào)傳導(dǎo)通路，而降低tau蛋白的磷酸化水平，進(jìn)一步發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。

5-羥基-1-氫-吲唑；MPP＋；SH-SY5Y；tau；GSK-3β；CDK5；凋亡；帕金森病

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，這種疾病的特征是黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元（dopamine，DA）的大量丟失，進(jìn)一步導(dǎo)致紋狀體內(nèi)多巴胺含量降低［1］。目前對(duì)于導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元凋亡的機(jī)制仍未明確。因此，探索調(diào)控神經(jīng)元凋亡的信號(hào)通路，并且在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)選擇性的干預(yù)凋亡信號(hào)傳遞通路關(guān)鍵靶點(diǎn)的抗神經(jīng)元凋亡藥物具有重要意義。Tau蛋白在PD發(fā)病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用［2］。而tau蛋白作為一種微管相關(guān)蛋白可被多種蛋白激酶磷酸化，其中對(duì)其磷酸化起重要作用的上游激酶是糖原合成激酶（GSK-3β）和周期依賴(lài)性蛋白激酶5（CDK5）［3］。其中CDK5的激活主要依賴(lài)于p35，然而在病理狀態(tài)下，p35水解為p25，p25同時(shí)具有促進(jìn)GSK-3β激活的作用。在AD患者中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)：p25的聚集可以促進(jìn)tau蛋白的過(guò)度磷酸化以及神經(jīng)元凋亡［4］。我們篩選了一系列可能對(duì)多巴胺神經(jīng)元具有保護(hù)作用的吲唑衍生物，發(fā)現(xiàn)一種單體化合物5-羥基-1-氫-吲唑?qū)PP＋誘導(dǎo)凋亡的SH-SY5Y細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，并進(jìn)一步探索了其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y購(gòu)自于上海細(xì)胞所。

1.2 藥品 5-羥基-1-氫-吲唑（Fig 1）、MPP＋、四氮唑鹽（MTT）、Hoechst 33258均購(gòu)自Sigma。5-羥基-1-氫-吲唑用DMSO溶解配成1 000×的儲(chǔ)備液，MPP＋用無(wú)血清的培養(yǎng)基配成100 mmol·L－1儲(chǔ)備液，兩者均貯存于－20℃冰箱，備用。

Fig 1 Structure of 5-hydroxy-1H-indazole

1.3 抗體 特異性酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxyase，TH）的rabbit多克隆抗體與特異性P-tau（Ser396）的goat多克隆抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司；P-GSK-3β（Ser9）購(gòu)自Cell Signaling Techology公司；P-GSK-3β（Try216）購(gòu)自BD公司。

1.4 主要儀器 CO2組織培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma Sci-entific公司）；倒置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；酶標(biāo)儀（BIO-RAD公司）；電泳儀（BIO-RAD公司）等。

1.5 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞用含10％胎牛血清的Basic DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，孵育在37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至適宜密度，胰蛋白酶消化傳代。

1.6 試驗(yàn)方法 SH-SY5Y細(xì)胞消化接種在96或24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的MPP＋和5-羥基-1-氫-吲唑，以MTT法［5］探索MPP＋的最適宜造模濃度，以及提前2h加入不同濃度的5-羥基-1-氫-吲唑?qū)H-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用；以Hoechst 33258熒光核染［6］觀察5-羥基-1-氫-吲唑?qū)Φ蛲黾?xì)胞核形態(tài)學(xué)的影響；以免疫細(xì)胞化學(xué)染色法［7］觀察5-羥基-1-氫-吲唑?qū)?xì)胞內(nèi)酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxyases，TH）含量的影響；以Western blot法［8］檢測(cè)磷酸化tau及其上游激酶：磷酸化糖原合成激酶（P-GSK-3β）與周期依賴(lài)性蛋白激酶5 （CDK5）的表達(dá)與活性，免疫印跡條帶運(yùn)用ger-pro analyzer進(jìn)行半定量分析，結(jié)果以相對(duì)光密度（rela-tive opticaldensity，ROD）表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，單因素間多組比較采用One-way ANOVA分析。

2 結(jié)果

2.1 MPP＋引起SH-SY5Y細(xì)胞存活率下降MPP＋對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性成濃度依賴(lài)性，MPP＋在1 000 μmol·L－1作用72 h后，與空白組細(xì)胞相比，其細(xì)胞存活率降至（53.58±0.81）％（P＜0.05），其濃度增加，細(xì)胞存活率不再明顯下降（Fig 2）。

Fig 2 MPP＋leaded SH-SY5Y cells death in a concentration-dependent manner

2.2 5-羥基-1-氫-吲唑保護(hù)MPP＋誘導(dǎo)死亡的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞 終濃度為0.1、1、10和100 μmol ·L－1的5-羥基-1-氫-吲唑提前2h加入培養(yǎng)基，1000 μmol·L－1MPP＋繼續(xù)作用72 h，細(xì)胞存活率與空白組相比分別為（81.29±0.96）％、（83.23± 0.82）％、（80.16±0.73）％、（73.40±0.67）％，與MPP＋組相比細(xì)胞存活率明顯提高（P＜0.01）（Fig 3A）。在無(wú)MPP＋處理的情況下，5-羥基-1-氫-吲唑單獨(dú)作用于SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞，與空白組相比，細(xì)胞存活率的改變沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（Fig 3B）。細(xì)胞內(nèi)多巴胺神經(jīng)元數(shù)目以酪氨酸羥化酶的ABC法進(jìn)行檢測(cè)，與空白組相比，MPP＋引起多巴胺能神經(jīng)元大量丟失，而0.1、1、10和100 μmol·L－15-羥基-1-氫-吲唑預(yù)處理會(huì)明顯抑制MPP＋導(dǎo)致的多巴胺神經(jīng)元數(shù)目的減少（Fig 3C）。

2.3 5-羥基-1-氫-吲唑抑制MPP＋誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡 SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核的凋亡情況應(yīng)用Hoechst 33258染色法進(jìn)行檢測(cè)。正常細(xì)胞核呈現(xiàn)圓形，并且彌散均勻分布，而凋亡的細(xì)胞核呈現(xiàn)體積縮小、固縮、凝聚、濃染等特征。在溶劑對(duì)照組內(nèi)，細(xì)胞核形態(tài)正常（Fig 4A），在1 000 μmol· L－1MPP＋處理72 h之后，細(xì)胞核呈現(xiàn)明顯凋亡（白色箭頭所示）（Fig 4B），而1 μmol·L－15-羥基-1-氫-吲唑預(yù)處理2 h之后，核凋亡明顯減輕（Fig 4C）。

2.4 MPP＋對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)P-tau及其上游激酶P-GSK-3β、CDK5蛋白水平的影響 Western blot結(jié)果顯示MPP＋可引起SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)tau的異常磷酸化（P＜0.05）（Fig 5），GSK-3β蛋白激活以及CDK5的活性提高（P＜0.05）（Fig 6），并且在MPP＋處理8 h時(shí)達(dá)到高峰。

2.5 5-羥基-1-氫-吲唑?qū)PP＋誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)P-tau、P-GSK-3β、CDK5蛋白水平變化的影響 Western blot的結(jié)果顯示，1 μmol·L－15-羥基-1-氫-吲唑預(yù)處理2h，MPP＋繼續(xù)作用8 h后與MPP＋組比較，細(xì)胞內(nèi)P-tau（Ser396）、P-GSK-3β（Tyr216）與p25的表達(dá)水平明顯降低，P-GSK-3β（Ser9）表達(dá)水平明顯增高（P＜0.01）（Fig 7）。

3 討論

PD是一種多發(fā)生在中、老年人中的一種慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)性障礙、靜止性震顫、肌強(qiáng)直等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。PD的癥狀和體征能夠被提高多巴胺功能的藥物緩解，其中最有效的是左旋多巴，但是左旋多巴出現(xiàn)的一系列副作用限制了它的廣泛應(yīng)用。更令人失望的是，如果長(zhǎng)期使用，左旋多巴可能損害神經(jīng)元，加速神經(jīng)元的凋亡［9］。因此迫切需要尋找能夠有效控制PD病程的神經(jīng)元保護(hù)性藥物。

Fig 3 5-Hydroxy-1H-indazole attenuated MPP＋-reduced cell viability

Fig 4 5-Hydroxy-1H-indazole inhibited MPP＋-induced SH-SY5Y cell nuclear apoptosis

Fig 5 MPP＋induced hyperphosphorylation of tau（Ser396）

Fig 6 Activities of GSK-3β and CDK5 were increased by MPP＋in SH-SY5Y cells

眾所周知，細(xì)胞凋亡在PD的神經(jīng)元退化過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用，但是介導(dǎo)PD中黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元凋亡是多條信號(hào)傳遞通路共同作用的結(jié)果。其中部分已知的不同信號(hào)通路的交叉點(diǎn)“tau蛋白”，由于在PD的病理發(fā)展進(jìn)程中扮演重要角色［10］，引起了人們的關(guān)注。以往的研究已經(jīng)證明，α-突觸核蛋白的錯(cuò)誤折疊和異常聚集是PD發(fā)病的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而tau蛋白和α-突觸核蛋白之間存在密切關(guān)系。tau蛋白和α-突觸核蛋白共同存在于路易氏體（LBs）內(nèi)，在80％偶發(fā)性PD或路易體癡呆（DLB）患者的髓質(zhì)中檢測(cè)到tau-免疫反應(yīng)的路易氏體（LBs），其中tau蛋白往往定位于LBs的周邊區(qū)域［11］。光密度研究表明，在PD患者額葉皮層的突觸富集區(qū)域有20％～40％的tau蛋白的Ser396位點(diǎn)磷酸化。臨床中發(fā)現(xiàn)，PD患者腦脊液中的tau蛋白水平是升高的［12］。已有研究報(bào)道，在PD患者尸檢中發(fā)現(xiàn)tau蛋白的磷酸化水平明顯提高。這些提示tau蛋白有望成為治療AD，PD等神經(jīng)退行性疾病的的理想靶點(diǎn)［13］。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，MPP＋可引起tau蛋白的異常磷酸化，并且在處理8h后達(dá)到高峰，而聯(lián)合應(yīng)用5-羥基-1-氫-吲唑，tau蛋白的磷酸化水平明顯降低，這提示5-羥基-1-氫-吲唑的神經(jīng)元保護(hù)作用可能與抑制tau蛋白的過(guò)磷酸化有關(guān)。

Fig 7 5-Hydroxy-1H-indazole reversed tau phosphorylation and decreased activities of GSK-3β and p25 induced by MPP＋

Tau蛋白可被多種蛋白激酶磷酸化，其中對(duì)其磷酸化起重要作用的上游激酶是GSK-3β和CDK5。以往研究也已證明，GSK-3β可作為防治PD的藥物作用靶點(diǎn)［14］。GSK-3β包含兩個(gè)重要的位點(diǎn)即Ser9 和Tyr216。P-GSK-3β（Ser9）抑制GSK-3β活性，P-GSK-3β（Tyr216）提高GSK-3β的活性［15］。我們的研究發(fā)現(xiàn)：MPP＋可降低P-GSK-3β（Ser9）水平，升高P-GSK-3β（Tyr216）水平，導(dǎo)致GSK-3β活化；而聯(lián)合應(yīng)用5-羥基-1-氫-吲唑可逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象，這提示5-羥基-1-氫-吲唑發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用可能與抑制GSK-3β的活性有關(guān)。p25的聚集對(duì)于CDK5的活性變化具有重要作用，我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)：MPP＋可引起p25的聚集，而聯(lián)合應(yīng)用5-羥基-1-氫-吲唑，可降低p25的積累，進(jìn)一步降低CDK5的水平。這提示5-羥基-1-氫-吲唑發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用與抑制CDK5的活性有關(guān)。以上也提示我們，5-羥基-1-氫-吲唑的神經(jīng)元保護(hù)作用可能與雙重抑制對(duì)神經(jīng)元凋亡起重要作用的關(guān)鍵激酶：GSK-3β和CDK5的活性有關(guān)，對(duì)控制PD的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程具有重要意義。

根據(jù)美國(guó)一個(gè)專(zhuān)利（US7629374B2，Use of Hydroxyindazole Derivatives for the Inhibition of Tau Phosphorylation），我們選擇一些結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，從中篩選出一系列可能具有潛在抑制tau蛋白過(guò)磷酸化的吲唑衍生物，幸運(yùn)地發(fā)現(xiàn)了5-羥基-1-氫-吲唑的神經(jīng)元保護(hù)作用。在以往的研究中也發(fā)現(xiàn)，6-羥基-1-氫-吲唑通過(guò)抑制tau蛋白磷酸化發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元的作用［7］。那么在吲唑衍生物的母核中引入其他不同基團(tuán)，是否同樣具有抑制tau蛋白過(guò)磷酸化的作用呢？抑制作用增強(qiáng)還是降低呢？這也提示我們對(duì)于這一系列具有不同官能基團(tuán)的化合物引起不同藥效學(xué)的探索具有重要意義。

綜上所述，5-羥基-1-氫-吲唑具有明顯的神經(jīng)元保護(hù)以及抗神經(jīng)元凋亡作用，而這種保護(hù)作用是與神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)的GSK-3β—tau，CDK5—tau通路有關(guān)。然而，5-羥基-1-氫-吲唑在體內(nèi)是否同樣具有多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)作用呢？我們擬將5-羥基-1-氫-吲唑應(yīng)用于MPTP PD小鼠模型中，觀察其對(duì)PD動(dòng)物模型形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)以及行為學(xué)等方面的影響，為5-羥基-1-氫-吲唑成為有效控制PD病程的神經(jīng)元保護(hù)藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

（致謝：本研究是在南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院臨床藥理研究所，在饒進(jìn)軍，王文雅兩位老師的悉心指導(dǎo)下，由徐圓圓、梁小鳳、朱雯婷參與完成。在此誠(chéng)摯感謝老師們以及同學(xué)們給與的幫助，使得實(shí)驗(yàn)得以順利完成！）

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The protective action and its mechanism of 5-hydroxy-1H-indazole in SH-SY5Y cells

XU Yuan-yuan1，LIANG Xiao-feng2，ZHU Wen-ting3，Rao Jin-jun1，WANG Wen-ya1
（1.Institute of Clinical Pharmacology，School of Pharmaceutical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；2.The Material＆Child Health Hospital，Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530003，China；3.School of Pharmaceutical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China）

Aim To study the protection and possible mechanism of 5-hydroxy-1H-indazole against 1-methyl-4-phenylpyridinium iodide（MPP＋）-induced SH-SY5Y cell apoptosis.Methods An apoptotic model was es-tablished in human neuroblastoma SH-SY5Y by MPP＋in vitro.MTT analysis was used to evaluate the protec-tive effect of 5-hydroxy-1H-indazole.Immunochemistry and Hoechst33258 nuclear staining were used to ob-serve the neuroprotection and anti-apoptosis of 5-hy-droxy-1H-indazole.Western blot was used to detect the levels of P-tau（Ser396）closely related to neuronal apoptosis and its upstream kinases：P-GSK-3β and CDK5.Results MPP＋induced activation of GSK-3β，increase of activity of CDK5，tau hyperphosphory- lation and neuronal cell apoptosis.However，5-hydrox-y-1H-indazole reduced the activities of GSK-3β and CDK5，then decreased the level of tau hyperphosphory-lation and inhibited MPP＋-induced SH-SY5Y cells ap-optosis.Conclusions 5-hydroxy-1H-indazole could attenuate MPP＋-induced SH-SY5Y neuronal cell apop-tosis.Possible mechanism is that 5-hydroxy-1H-in- dazole inhibits GSK-3β and CDK5 two signal transduc-tion pathways to lower the level of tau phosphorylation，then plays a role of neuroprotection.

5-hydroxy-1H-indazole；MPP＋；SH-SY5Y；tau；GSK-3β；CDK5；apoptosis；Parkinson’s disease

時(shí)間：2016－2－26 10：20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.032.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.016

A

1001－1978（2016）03－0378－07

R329.25；R322.81；R345.57；R745.7；R916.4

2015－11－11，

2015－12－17

廣東省省部產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目（No 2012B091100465）

徐圓圓（1991－），女，碩士，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，Tel/Fax：020-61648535，E-mail：xyy0369＠163.com；王文雅（1970－），女，博士，教授，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，通訊作者，Tel/Fax：020-61648535，E-mail：wangwy＠fim-mu.com；饒進(jìn)軍（1963－），男，博士，副教授，研究方向：腫瘤藥理學(xué)，Tel/Fax：020-61648535，E-mail：araojj＠fimmu.com