HSP70抑制劑PFTμ對干擾素γ誘導的iNOS表達的研究

袁小媚，雷 寒，夏 勇

（1.四川省人民醫院心血管科，四川成都 621000；2.重慶醫科大學附屬第一醫院心內科，重慶 400016；3.美國俄亥俄州立大學醫學中心Davis心肺研究所，美國 43210）

HSP70抑制劑PFTμ對干擾素γ誘導的iNOS表達的研究

袁小媚1，2，3，雷 寒2，夏 勇3

（1.四川省人民醫院心血管科，四川成都 621000；2.重慶醫科大學附屬第一醫院心內科，重慶 400016；3.美國俄亥俄州立大學醫學中心Davis心肺研究所，美國 43210）

目的 觀察熱休克蛋白70抑制劑PFTμ對干擾素γ （IFN-γ）誘導的RAW 264.7細胞一氧化氮（NO）的生成及誘生型一氧化氮合酶（iNOS）表達的作用。方法 采用IFN-γ誘導的RAW 264.7細胞株建立細胞炎癥反應模型，采用Griess試劑法測定細胞NO釋放量；采用Western blot法測定相應目的蛋白的表達；采用反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）分析iNOS mRNA表達的變化。建立小鼠心臟缺血/再灌注（I/R）模型，分為對照組和給藥組，測定小鼠心肌梗死面積的變化。結果 PFTμ可抑制IFN-γ誘導的RAW264.7細胞NO的生成、iNOS蛋白及mRNA表達。其作用機制可能是通過部分抑制RAW264.7細胞核內的IRF-1蛋白表達。PFTμ可減少缺血/再灌注小鼠心臟梗死面積（P＜0.05）。結論PFTμ可通過部分抑制細胞核內IRF-1蛋白表達而發揮抗炎癥反應的作用。

熱休克蛋白；干擾素γ；一氧化氮；誘生型一氧化氮合酶；PFTμ；缺血/再灌注損傷

巨噬細胞在外部細菌毒素如干擾素γ（IFN-γ）等刺激時，可促使炎癥介質如一氧化氮（NO）等的分泌，這被廣泛應用于研究炎癥反應。Pifithrin-μ （PFTμ）是近期新報道的一種小分子，它是一種熱休克蛋白70（HSP70）抑制劑，能夠選擇性抑制HSP70的蛋白質功能［1］。因此，本研究以IFN-γ誘導RAW264.7細胞為反應模型，擬探討HSP70抑制劑PFTμ在炎癥反應中的作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 IFN-γ、TRIzol提取試劑盒等購于Sigma公司，PFTμ購于CalBiochem公司，iNOS購于BD公司。DMEM培養基、Griess Reagent試劑盒、反轉錄聚合酶鏈反應試劑盒等購于Invitrogen公司，胎牛血清購于Gibco公司。蛋白濃度測量試劑購于Bio-Rad公司。

1.1.2 細胞與實驗動物及其分組 RAW 264.7小鼠巨噬細胞和♂C57BL/6小鼠（20～30 g）由美國俄亥俄州立大學醫學中心實驗動物中心提供。細胞實驗分組：給藥組中加入PFTμ（終濃度20 μmol· L－1）預處理15 min后，再加入IFN-γ（終濃度2 mg ·L－1），對照組中加入等量DMSO預處理相同時間后，再加入同等IFN-γ。實驗重復至少3次。C57BL/6♂小鼠隨機分為2組：對照組10只，給藥組（PFTμ 40 mg·kg－1，溶于DMSO腹腔注射）10只。

1.2 方法

1.2.1 一氧化氮測定 根據Griess Reagent試劑盒說明書，將300 μL溶液［20 μL Griess試劑、150 μL細胞培養液（對照組和給藥組）、130 μL去離子水］混合于96孔板的孔中，20 μL Griess試劑加280 μL去離子水作為空白對照。室溫下放置30 min后，用分光光度儀測量每孔混合液的吸光度（波長548 nm），并校正曲線。

1.2.2 Western blot測定 用PBS液收集RAW 264.7細胞，3 000～3 500 r·min－1室溫下離心3～5 min，根據沉淀大小加入細胞裂解液（RIPA 89％，PIC 10％，EDTA 1％），置于冰上30 min，再12 000 r ·min－14℃離心15 min。將上清液轉至新管后，取其中5 μL測定蛋白濃度，根據濃度計算配比等質量的樣品，99℃5 min蛋白變性。150 V，1.5％膠電泳1 h，醋酸紙浸入轉膜液15 min。15 V、35 min（一塊膠）～45 min（兩塊膠）轉膜。5％脫脂牛奶室溫下孵育1 h，TBST洗3次，加入一抗4℃過夜。TBST再洗3次，加入二抗（1％脫脂牛奶稀釋1∶5 000），室溫下孵育1h，TBST洗3次，室溫下顯影液孵育5 min，暗室顯影。

1.2.3 RT-PCR 總RNA按照TRIzol抽提試劑說明書進行。取8 μL做凝膠電泳，其余置－80℃保存備用。PCR反應體系條件如下：預變性94℃30 s，變性94℃30 s，退火60℃30 s，延伸72℃1 min，25個循環，最后延伸72℃7min。結束后，反應產物經1％瓊脂糖凝膠電泳（95V，30 min）鑒定，用凝膠成像儀進行灰度掃描分析。

1.2.4 細胞核提取 用PBS液收集細胞后3 000 r ·min－1，5 min，4℃離心，加入250～500 μL低滲緩沖液，冰上放置20 min（10 mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.5，10 mmol·L－1NaCl，1.5 mmol·L－1MgCl2），均勻勻漿20次；3 000 r·min－1，5 min，4℃離心，吸走上清液；每管加入0.5 mL低滲緩沖液，輕輕混合沉淀，再離心，反復2次；每管再加入RIPA 50～80 μL冰上放置30 min，測細胞蛋白濃度配樣本。

1.2.5 小鼠I/R模型的建立及梗死面積的測定實驗分組見“1.1.2”，建立小鼠I/R模型。結扎心臟左冠狀動脈前降支1 h，再灌注24 h后，取小鼠心臟標本PBS清洗，扎緊冠狀動脈左前降支，由主動脈推入1％Evan-Blue液2～3 mL，－20℃冰凍30 min后，將心臟從心尖到心基底部平行切成2 mm厚度的小片，置于1.5％氯化三苯基四氮唑（TTC）37℃孵育10～30 min，染色后，置于10％甲醛中固定，可見梗死區呈現白色，再灌注區呈現紅色，正常心肌組織區呈現藍色。照相并軟件分析計算出缺血危險區（AAR）和梗死區（IS）的面積，用每張切片重量計算百分比，心肌梗死程度以IS/AAR來表示。

1.2.6 統計學處理 采用SPSS 10.0統計軟件對數據進行配對資料t檢驗。

2 結果

2.1 PFTμ不同時間對IFN-γ誘導的RAW264.7細胞釋放一氧化氮的影響 結果顯示，0～4 h，PFTμ組、對照組中NO含量基本無變化；8 h起，IFN-γ組NO含量開始上升，與對照組比較差異有顯著性（P＜0.05）；隨著時間延長，IFN-γ組釋放的NO量繼續增加，在8～12 h間升高幅度最大。PFTμ組與IFN-γ組走勢相似，但NO含量要明顯低于IFN-γ組，兩組比較差異有顯著性（P＜0.05）。這表明在0～12 h之間，PFTμ呈現時間依賴性地降低IFN-γ誘導的RAW264.7細胞釋放一氧化氮（Fig 1）。

2.2 PFTμ不同時間對IFN-γ誘導的RAW264.7細胞iNOS蛋白表達的影響 結果顯示，0～4 h，PFTμ組、對照組中iNOS蛋白表達基本無變化；在8 h時，IFN-γ開始誘導RAW264.7細胞大量表達iN-OS蛋白，8～12 h之間iNOS蛋白表達逐漸增多。而PFTμ組8～12 h之間無iNOS蛋白表達，提示PFTμ（終濃度20 μmol·L－1）能明顯抑制IFN-γ誘導的iNOS蛋白表達。這表明在0～12 h之間，PFTμ呈現時間依賴性地抑制IFN-γ誘導的RAW264.7細胞iNOS蛋白表達（Fig 2）。

2.3 PFTμ不同時間對IFN-γ誘導的RAW264.7細胞iNOS mRNA的影響 結果顯示，0～4 h，PFTμ組、對照組中iNOS mRNA表達基本無變化；4 ～8 h時，IFN-γ開始誘導RAW264.7細胞大量表達iNOS mRNA，而PFTμ組iNOS mRNA無表達，提示PFTμ（終濃度20 μmol·L－1）能明顯抑制IFN-γ誘導iNOS mRNA表達。這表明在0～8 h之間，PFTμ呈現時間依賴性地降低IFN-γ誘導的RAW264.7細胞iNOS mRNA的表達（Fig 3）。

Fig 3 Effect of PFTμ on iNOS mRNA expression in RAW 264.7 cells induced by IFN-γ

2.4 PFTμ不同時間對IFN-γ誘導的RAW264.7細胞Stat1蛋白表達的影響 結果顯示，在0～4 h之間，IFN-γ開始刺激RAW264.7細胞磷酸化Stat1 （Ser727Stat1和Tyr701Stat1）蛋白的表達，而PFTμ組磷酸化的Stat1表達無明顯變化，提示PFTμ對IFN- γ誘導的Stat1蛋白表達無明顯影響。這表明在0～4 h之間，PFTμ沒有通過抑制Stat1蛋白表達而發揮抑制iNOS表達的作用（Fig 4）。

Fig 4 Effect of PFTμ pretreatment on IFN-γ-induced phosphorylated-Stat1 activation in RAW264.7 cells

2.5 PFTμ對IFN-γ誘導的RAW264.7細胞核IRF-1蛋白表達的影響 結果顯示，空白組細胞核有少量IRF-1蛋白表達，IFN-γ組細胞核IRF-1蛋白表達增加，而PFTμ組IRF-1蛋白表達明顯減少（P ＜0.05），提示PFTμ對IFN-γ誘導的細胞核內IRF-1蛋白表達有抑制作用。這表明早期PFTμ通過部分抑制細胞核內IRF-1蛋白表達而發揮抑制iNOS表達的作用（Fig 5）。

2.6 PFTμ對小鼠I/R心肌梗死面積的影響 結果顯示，對照組和給藥組比較發現，給藥組心肌梗死面積明顯小于對照組（P＜0.05）。結果提示PFTμ （40 mg·kg－1，腹腔注射）能明顯降低I/R小鼠心肌梗死面積（Fig 6）。

3 討論

熱休克蛋白70功能較多，與細胞耐熱性的產生有關，是主要伴侶蛋白之一，并可能是機體衰老或細胞老化的一個重要因素等等，因而成為熱休克蛋白中關注最廣、研究最深的一種。本實驗我們選擇以一氧化氮為靶點分子，研究熱休克蛋白70抑制劑PFTμ在炎癥作用中的作用及其分子機制，關于這一研究內容國內外文獻報道較少。NO的大量生成與炎癥反應密切相關，它是一種具有生物活性的氣體分子，是細胞間信息傳遞的重要調節因子，具有介導細胞免疫和炎癥毒性的功能。在活化的巨噬細胞中，iNOS水平對一氧化氮的產生起到關鍵的作用。調節一氧化氮生成或誘生型一氧化氮合酶表達可能是治療炎癥反應的重要靶點［2］。

Fig 5 Western blot analysis of IRF-1 protein from nuclear extracts in RAW 264.7 cells

Fig 6 Mouse experiment

PFTμ是最近報道的一種小分子，在抑制癌癥反應方面有著明顯的作用，能選擇性地與壓力誘導的熱休克蛋白70相互影響，并抑制其功能。iNOS在生理情況下表達量很少，但在一系列炎癥因子的刺激下，可發生iNOS的基因轉錄和蛋白質的表達。合成的一氧化氮不僅直接導致細胞損傷，同時加重炎癥反應［3］。熱休克蛋白70對心肌細胞損傷的保護作用引起了國內外心血管界的高度重視［4］。有研究報道［5］發現，缺血預處理的保護作用不是熱休克蛋白產生，其主要作用是由一氧化氮產生。同時，大量研究表明［6－9］，缺血預處理的發生是由iNOS途徑介導的。我們研究報道首次發現，PFTμ對IFN-γ誘導的RAW264.7細胞NO的釋放呈現時間依賴性的抑制作用，同時對IFN-γ誘導的iNOS蛋白及mR-NA的表達呈現時間依賴性的抑制作用，從而我們推測，PFTμ對RAW264.7細胞NO的影響與改變iNOS表達量的變化有關。

大量研究報道表明［10－13］，與IFN-γ密切相關的信號轉導通路有幾條，最主要的是JAK-Stat1信號通路，其主要的下游蛋白是磷酸化的Stat1，而PFTμ與多條信號轉導通路有關聯［1］。本實驗首次研究發現，在0～4 h之間，PFTμ沒有通過抑制RAW264.7細胞中Stat1蛋白的表達而發揮抑制iN-OS表達的作用，從而推測PFTμ抑制RAW264.7細胞中IFN-γ誘導的iNOS表達的作用機制與JAK-Stat1通路無關，這在國內外尚未見文獻報道。IRF-1（interferon regulatory factor 1）在IFN-γ刺激的iN-OS轉錄過程中發揮著重要的作用。有報道顯示，IRF-1介導IFN-γ誘導的iNOS表達，而IRF-1缺失小鼠不能誘導iNOS表達［14－16］。我們研究發現，PFTμ對IFN-γ誘導的RAW264.7細胞核內IRF-1蛋白表達有抑制作用。這表明早期PFTμ通過部分抑制細胞核內IRF-1蛋白表達而發揮抑制iNOS表達的作用。

缺血/再灌注損傷是最常見的炎癥反應。本實驗發現，PFTμ作為HSP70的選擇性抑制劑，明顯降低了I/R小鼠的心肌梗死面積，提示PFTμ對心臟具有一定的保護作用。有研究報道［5］，缺血預處理的保護作用不是由HSP產生的，其主要作用是由NO產生的。同時，大量研究表明，缺血預處理的發生是由iNOS途徑介導的，某些藥物也可明顯抑制IFN-γ誘導iNOS的表達［17］。我們推測，PFTμ可能通過抑制NO的生成和iNOS的表達而發揮作用。

綜上所述，我們研究報道發現，HSP70抑制劑PFTμ明顯抑制IFN-γ誘導的RAW264.7細胞NO的生成、iNOS蛋白及mRNA的表達，其作用機制可能是通過早期部分抑制RAW264.7細胞核內IRF-1蛋白表達來實現的。這部分研究內容國內外報道少。關于PFTμ更深入的分子生物學作用機制我們正在做大量的工作。

［1］ Leu J J，Pimkina J，Frank A，et al.A small molecule inhibitor of inducible heat shock protein 70［J］.Mol Cell，2009，36（1）：15 －27.

［2］ Luo S，Lei H，Qin H，et al.Molecular mechanisms of endothelial NO synthase uncoupling［J］.Curr Pharm Des，2014，20（22）：3548－53.

［3］ Qi W N，Chaiyakit P，Cai Y，et al.NF-kappa-B p65 involves in reperfusion injury and iNOS gene regulation in skeletal muscle ［J］.Microsurgery，2004，24（4）：316－23.

［4］ Afzal A R，Mandal K，Nyamweya S，et al.Association of Met439Thr substitution in heat shock protein 70 gene with postop-erative atrial fibrillation and serum HSP70 protein levels［J］.Car-diaology，2008，110（1）：45－52.

［5］ Qian Y Z，Shipley J B，Levasseur J E，et al.Dissociation of heat shock proteins expression with ischemic tolerance by whole body-hyperthermia in rat heart［J］.J Mol Cell Cardio，1998，30（6）：1163－72.

［6］ Zhang L，Liu Q，Yuan X，et al.Requirement of heat shock pro-tein 70 for inducible nitric oxide synthase induction［J］.Cell Sig-nal，2013，25（5）：1310－7.

［7］ Wang T，Xia Y.Inducible nitric oxide synthase aggresome forma-tion is mediated by nitric oxide［J］.Biochem Biophys Res Com-mun，2012，426（3）：386－9.

［8］ Xiao Z，Wang T，Qin H，et al.Endoplasmic reticulum Ca2＋re-lease modulates endothelial nitric-oxide synthase via extracellular signal-regulated kinase（ERK）1/2-mediated serine 635 phospho-rylation［J］.J Biol Chem，2011，286（22）：20100－8.

［9］ Luo S，Wang T，Lei H，et al.Obligatory role of heat shock protein 90 in iNOS induction［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2011，301 （1）：C227－33.

［10］Darnell J E，Kerr I M，Stark G R.Jak-STAT pathways and tran-scriptional activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins.Science，1994，264（5164）：1415－21.

［11］Ramana C V，Gil M P，Schreiber R D，Stark G R.Stat1-depend-ent andindependent pathways in IFN-γ-dependent signaling ［J］.Trends Immunol，2002，23（2）：96－101.

［12］Meraz M A，White J M，Sheehan K C，et al.Targeted disruption of the Stat1 gene in mice reveals unexpected physiologic specificity in the JAK-STAT signaling pathway［J］.Cell，1996，84（3）：443 －50.

［13］Durbin J E，Hackenmiller R，Simon M C，et al.Targeted disrup-tion of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immu-nity to viral disease［J］.Cell，1996，84（3）：443－50.

［14］Kamijo R，Harada H，Matsuyama T，et al.Requirement for tran-scription factor IRF-1 in NO synthase induction in macrophages ［J］.Science，1994，263（5153）：1612－5.

［15］Sims S H，Cha Y，Romine M F，et al.A novel interferon-induc-ible domain：structural and functional analysis of the human inter-feron regulatory factor I gene promoter.Mol Cell Biol，1993，13 （1）：690－702.

［16］Coccia E M，Stellacci E，Marziali G，et al.IFN-gamma and IL-4 differently regulate inducible NO synthase gene expression through IRF-1 modulation［J］.Int Immunol，2000，12（7）：977－85.

［17］Chiou W F，Don M J，Liao J F，et al.Psoralidin inhibits LPS-in-duced iNOS expression via repressing Syk-mediated activation of PI3K-IKK-IκB signaling pathways［J］.Eur J Pharmacol，2011，650（1）：102－9.

Effects of HSP70 inhibitor on expression of iNOS induced by IFN-γ

YUAN Xiao-mei1，2，3，LEI Han2，XIA Yong3
（1.Sichuan Academy of Medical Sciences＆Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 621000，China；2.Dept of Cardiology，First Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；3.Davis Heart and Lung Research Institute，Division of Cardiovascular Medicine，Dept of Internal Medicine，the Ohio State University，Columbus，OH 43210，USA）

Aim To research the effects of HSP70 in-hibitor（PFTμ）on the expressions of iNOS induced by IFN-γ in RAW 264.7 cells.Methods The NO con-centration was measured by Griess Kit.The expression of interest protein was measured by Western blot and iNOS mRNA was measured by RT-PCR.Mouse cardi-ac ischemia-reperfusion（I/R）model was established to set up the inflammatory response.These were divid-ed into control and treated groups.The infarct size was monitored on myocardial I/R mice.Results We found that PFTμ significantly blocked the production of NO and the expression of iNOS protein and mRNA in RAW 264.7 cells.The mechanism may be part of the inhibition of nuclear IRF-1 protein expression.We also found that PFTμ reduced the infarct size in myocardial I/R mice（P＜0.05）.Conclusion These results suggest that PFTμ down-regulates the IFN-γ-induced iNOS transcription through decreasing translocated IRF-1 protein.

HSP；IFN-γ；NO；iNOS；PFTμ；ische-mia-reperfusion injury

時間：2016－2－26 10：20 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.036.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.018

A

1001－1978（2016）03－0390－05

R-332；R341；R542.202.2；R977.3；R977.6

2015－10－15，

2015－11－16

袁小媚（1981－），女，博士，主治醫師，研究方向：冠心病的發病機制，E-mail：yuanxiaomei0903＠126.com；雷 寒（1957－），男，博士，教授，博士生導師，研究方向：冠心病的發病機制，通訊作者，E-mail：hanleicq＠hotmail.com