阿魏酸鈉治療糖皮質激素性骨質疏松的實驗研究

劉 洋，陳 臖，翟玉瑩，葉小天，肖 珊，柯詩韻，李青南，楊國柱，盧 麗，陸幸妍

（廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院/廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣東廣州 510006）

阿魏酸鈉治療糖皮質激素性骨質疏松的實驗研究

劉 洋，陳 臖，翟玉瑩，葉小天，肖 珊，柯詩韻，李青南，楊國柱，盧 麗，陸幸妍

（廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院/廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣東廣州 510006）

目的 探討阿魏酸鈉對于大鼠糖皮質激素性骨質疏松癥的治療作用。方法 3月齡Wistar大鼠隨機均分5組：對照組、模型組、治療組（阿魏酸鈉低、中、高劑量組）。動物處死前進行鈣黃綠素雙熒光標記。采用骨組織形態計量學方法測量脛骨的靜態參數、動態參數、骨組織細胞和生長板變化。結果 ①靜態參數：與對照組相比，模型組骨小梁面積百分數、骨小梁厚度、骨小梁數量明顯減少，骨小梁分離度增大；與模型組相比，阿魏酸鈉中、高劑量組骨小梁面積百分數、骨小梁厚度、骨小梁數量明顯增加，骨小梁分離度明顯減小。低劑量組骨小梁厚度明顯增加。②動態參數：與對照組相比，模型組標記周長百分數、骨轉化率、骨表面新骨形成率明顯增大；與模型組相比，中、高劑量組新骨年形成率增加。③骨組織細胞：與對照組相比，模型組單位骨小梁面積成骨細胞數量、破骨細胞數量以及成骨細胞周長占骨小梁周長百分率均明顯增加。與模型組相比：各個實驗組均沒有明顯變化。④生長板：與對照組相比，模型組生長板寬明顯增大；與模型組相比，各實驗組生長板退行細胞高度、生長板寬均沒有明顯變化。結論 阿魏酸鈉對糖皮質激素性骨質疏松的治療作用主要體現在增加骨量和改善骨小梁結構，并促進骨形成。

糖皮質激素性骨質疏松；阿魏酸鈉；骨組織形態計量學；骨組織細胞；生長板；骨小梁；松質骨

糖皮質激素性骨質疏松癥（glucocorticoid-in-duced osteoporosis，GIOP）是目前發病率最高最常見的繼發性骨質疏松癥。糖皮質激素誘導的細胞氧化應激反應，損傷成骨細胞、使成骨細胞凋亡增加［1］。但由于其強大抗炎和免疫抑制作用，很多患者必須長期甚至終生大劑量使用糖皮質激素［2］。現有研究多是針對糖皮質激素用藥時骨骼的變化，而對停藥后及停藥后藥物治療對大鼠骨骼變化的研究較少。

阿魏酸鈉（sodium ferulate，SF）是一種穩定的、低毒性、水溶性內皮素受體拮抗劑，具有防止DNA的損傷，抗細胞凋亡，保護內皮細胞，促進血管平滑肌細胞增殖，改善局部血液供給等多種生理功能［3］。已有研究發現SF具有刺激體外培養的成骨細胞（osteoblast，Ob）增殖、分化和礦化的功能，可以促進成骨相關基因的表達［4］。近來有國外學者報道，應用阿魏酸鈉來治療骨關節炎、軟骨退變取得了較好的療效［5］。阿魏酸鈉有較強的舒張血管的作用，可有效減輕血流瘀滯狀態［6］，減少骨壞死的發生率；另據報道，阿魏酸鈉可以有效地促進去卵巢大鼠的骨重建作用，抑制去卵巢大鼠骨吸收作用［7－8］。但是對于糖皮質激素性骨質疏松癥干預治療的研究，尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 3月齡♀Wistar大鼠30只（SPF級，中山大學動物中心提供），許可證號：44008500006272，體質量（220±15）g，標準飼料，室溫。

1.1.2 藥品與試劑 地塞米松磷酸鈉注射液（辰欣藥業股份有限公司，批號：1405216421，規格1 ml：2 mg）、熒光標記物Calcein（Sigma Chemcal Co.USA）；2-Methyloxethyl acetate（Sigma Chemcal Co.USA）；甲基丙烯酸甲酯（成都市新都區木蘭鎮工業開發區）；鄰苯二甲酸二丁酯（成都市科龍化工試劑廠）；過氧化苯甲酰（天津市福晨化學試劑廠）。

1.1.3 儀器 硬組織切片機（德國Leica RM2255）；骨組織形態計量學測量系統（美國BIOQUANT OS-TEO公司）。

1.2 動物分組和實驗處理

1.2.1 動物分組 Wistar大鼠隨機分成5組：對照組（Con組肌肉注射生理鹽水120 d）；模型組［Mod組肌注地塞米松（Dex）1 mg·kg－1每周5次，90 d，停藥肌注生理鹽水恢復30 d］；阿魏酸鈉治療組［低、中、高劑量組（Low、Mid、Hig組），肌注Dex 1 mg·kg－1，每周5次，90 d，停藥10 d，分別肌注阿魏酸鈉（20、40、80 mg·kg－1·d－1，20 d）］。

1.2.2 動物處理 所有大鼠每周稱體重1次。并按體重變化調整給藥量。所有動物處死前d 14、13 和d 4、3分別皮下注射鈣黃綠素，進行雙熒光標記。取實驗組大鼠脛骨，經不脫鈣包埋后，根據文獻方法［9］，用Leica RM2255型切片機（Leica Co.Germa-ny）將PTM松質骨切出5 μm薄片和9 μm厚片，5 μm薄片經脫塑后采用甲苯胺藍染色法對切片染色，9 μm經脫塑后熒光下觀察。

1.3 骨組織形態計量學 采用骨組織形態計量學方法進行靜態參數測量，通過相關靜態參數包括骨小梁面積百分數（％Tb.Ar）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數量（Tb.N）、骨小梁分離度（Tb.Sp），分析各組大鼠脛骨近心端松質骨骨量和骨結構變化情況。通過相關動態參數包括骨礦化沉積率（MAR）、標記周長百分數（％L.Pm）、新骨年形成率（BFR/TV）、骨轉化率（BFR/BV）、骨表面新骨形成率（BFR/BS），分析各組大鼠脛骨近心端松質骨骨形成和骨代謝的變化情況［10－11］；通過相關骨細胞參數包括單位骨小梁面積成骨細胞數量（Ob.N/BS）、破骨細胞數量（Oc.N/BS）；以及成骨細胞周長占骨小梁周長百分率（％Ob.S/BS）和破骨細胞周長占骨小梁周長百分率（％Oc.S/BS）。松質骨生長板變化情況測量其生長板寬（G.P.Wi）和退行細胞高度（D.C.H）。

2 結果

Tab 1 Comparison of static parameters of cancellous bone proximal tibia in different groups（±s，n＝6）

Tab 1 Comparison of static parameters of cancellous bone proximal tibia in different groups（±s，n＝6）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model

4.78 Mod 19.13±2.26** 25.31±0.48** 7.52±0.75** 111.81±14.08**Low 32.63±1.84* 39.82±1.67＃＃ 8.22±0.51* 83.21±7.04 Mid 38.10±2.69＃＃ 36.69±1.38＃＃ 10.39±0.71＃ 60.88±6.70＃＃Hig 36.68±3.36＃＃ 38.55±1.59＃＃＃ 9.49±0.64＃ 68.12±7.11 Group ％Tb.Ar/％ Tb.Th/μm Tb.N/No·mm－1 Tb.Sp/μm Con 45.51±3.24 40.13±1.67 11.32±0.52 48.76± ＃

2.1 PTM骨量骨結構變化 如Fig 1、Tab 1所示：與對照組相比，模型組％Tb.Ar減小（P＜0.01），Tb.Th明顯減小（P＜0.01），Tb.N明顯減少（P＜ 0.01），Tb.Sp明顯增大（P＜0.01）。與模型組相比，阿魏酸鈉中、高劑量組％Tb.Ar增大（P＜0.01），Tb.Th明顯增加（P＜0.01），Tb.Sp明顯增大（P＜0.05）。Tb.Sp明顯減少（高劑量組P＜0.05，中劑量組P＜0.01）。

Tab 2 Comparison of dynamic parameters of cancellous bone proximal tibia in different groups（±s，n＝6）

Tab 2 Comparison of dynamic parameters of cancellous bone proximal tibia in different groups（±s，n＝6）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model

Group MAR/μm ％L.Pm/％ BFR/TV/％·y－1 BFR/BV/％·y－1 BFR/BS/％·y －1 Con 1.22±0.08 2.63±0.29 21.21±1.84 61.34±5.24 1151±64.83 Mod 1.14±0.05 6.13±0.92* 28.57±3.50 202.4±32.39** 2557±403.1*Low 1.17±0.08 7.59±0.62** 46.31±5.40** 155.1±20.00** 3320±511.9**Mid 1.49±0.16 7.56±1.03** 65.40±5.09**＃＃ 217.8±18.83** 4014±439.4**Hig 1.39±0.14 6.57±1.09* 51.53±9.94*＃ 175.8±33.95* 3446±719.0*

Tab 3 Comparison of bone formation and resorption parameters of cancellous bone proximal tibia in different groups（±s，n＝6）

Tab 3 Comparison of bone formation and resorption parameters of cancellous bone proximal tibia in different groups（±s，n＝6）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control.

Group Ob.N/BS/N·mm－1 ％Ob.S/BS/％ Oc.N/BS/No·mm－1％Oc.S/BS/％ Con 3.61±0.55 97.07±16.92 3.43±0.60 46.68±9.85 Mod 8.41±1.46* 336.0±83.14* 8.19±1.432* 219.9±45.37**Low 7.96±1.43* 248.0±63.42* 7.034±1.77 153.2±16.39**Mid 6.18±1.08 355.5±94.49* 8.59±1.53* 134.3±15.53**Hig 8.98±0.47** 323.9±57.40** 7.77±0.97** 220.6±14.33**

Fig 1 Effects of dexametha-sone and dexamethasone plus SF at different doses on bone histomorphometry of cancel-lous bone proximal tibia in Toluidine blue-stained（5 μm，×20）

Fig 2 Fluorescent Calcein markers in bone formation of proximal tibia（9 μm，×100）

2.2 PTM骨形成骨代謝影響 如Fig 2、Tab 2所示：與對照組相比，模型組％L.Pm明顯增大（P＜0.05），BFR/BV明顯增大（P＜0.01），BFR/BS明顯增大（P＜0.05）。與模型組相比，阿魏酸鈉中、高劑量組新骨年形成率明顯增大（中劑量組P＜0.01，高劑量組P＜0.05）。

2.3 PTM骨組織細胞 骨小梁表面成骨細胞和破骨細胞如Fig 3、Tab 3所示：與對照組相比，模型組Ob.N/BS、％Ob.S/BS、Oc.N/BS明顯增加（P＜0.05），％Oc.S/BS明顯增加（P＜0.01）。與模型組相比，各個實驗組均沒有明顯變化。

Fig 3 Osteoblast（dashed lines）and osteoclast（solid lines）in adjacent trabecular bone labeled in Toluidine blue-stained（5 μm，×200）

2.4 PTM生長板影響 如Fig 4、Tab 4所示：與對照組相比，模型組生長板寬明顯增大（P＜0.05）。與模型組相比，阿魏酸鈉各組生長板退行細胞高度、生長板寬均沒有明顯變化。

Fig 4 Effects of dexametha-sone and dexamethasone plus SF in different dose on bone histomorphometry of growth plate（5 μm，×200）

Tab 4 Comparison of histomorphometry parameter of growth plate in different groups（±s，n＝6）

Tab 4 Comparison of histomorphometry parameter of growth plate in different groups（±s，n＝6）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Group G.P.Wi/μm D.C.H/μm Con 73.21±2.93 11.97±0.73 Mod 89.38±4.61* 15.39±1.96 Low 95.37±8.56* 15.52±1.37 Mid 93.15±7.51* 15.66±1.33 Hig 95.27±4.45** 18.18±1.37***

3 討論

骨代謝平衡是指成骨細胞的骨形成作用生成新骨，破骨細胞的骨吸收作用吸收舊骨，骨形成和骨吸收動態平衡［12］，而骨量的改變是骨代謝平衡的結果。目前研究普遍認為，糖皮質激素給藥，抑制了腸鈣吸收及骨鈣、磷重吸收，會促進成骨細胞和骨細胞的凋亡，使成骨細胞失活，抑制成骨細胞的功能［13］。停用糖皮質激素，成骨細胞的功能可逐漸恢復，隨著停用時間的延長，骨質疏松癥狀有所恢復［14］。本實驗結果顯示模型組骨形成明顯增加，在細胞水平發現模型組成骨細胞和破骨細胞都增加，但骨量和骨小梁結構沒有恢復，原因可能是停藥30 d的時間增加骨轉換，但不足以大鼠骨質疏松癥狀完全恢復。

有研究表明，阿魏酸鈉通過抑制炎癥反應，可以維護缺血區域神經元的基本結構功能［15］；同時阿魏酸鈉還可以提高VEGF以及其它骨生長因子，如TGF-13、BMP等表達，從而促進了局部血管增生和成骨細胞分化，使成骨細胞活性增強［16］；本研究中阿魏酸鈉促進成骨細胞增殖作用不明顯，但是其明顯增強成骨細胞的骨形成作用。另外阿魏酸鈉上的酚羥基結構可使氧自由基發生還原反應，降低氧自由基水平，減少氧自由基對細胞和組織的損害等作用［17－18］。本研究發現與模型組相比，阿魏酸鈉組骨轉化明顯增加，這可能是由于阿魏酸鈉對細胞的保護從而使成骨細胞在骨的形成和修復中發揮作用。

生長板是位于長骨兩端骨骺和骨干之間的軟骨組織。可分裂、成熟、肥大，以軟骨內成骨的方式對于長骨生長具有重要作用［19］。大鼠成熟后，軟骨增殖潛能逐漸下降［20］，本實驗所用大鼠為7月齡，糖皮質激素使用90 d，停藥30 d后模型組軟骨細胞增殖區面積增大，這顯示停用糖皮質激素后刺激軟骨增殖能力。

綜上所述：本研究發現糖皮質激素使用90 d，停藥30 d后，模型組的骨量減少和骨結構被破壞的情況沒有恢復；而應用阿魏酸鈉治療可以通過促進骨轉化增加骨量和改善骨小梁結構。

（致謝：本研究相關實驗主要在廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院骨骼與骨骼肌疾病研究室和廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室完成，感謝以上實驗室的老師對本研究給予的支持。）

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Effect of Sodium ferulate on glucocorticoid-induced osteoporosis

LIU Yang，CHEN Jun，ZHAI Yu-ying，YE Xiao-tian，XIAO Shan，KE Shi-yun，LI Qing-nan，YANG Guo-zhu，LU Li，LU Xing-yan
（School of Life Science and Biopharmacy，Guangdong Pharmaceutical University/Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology Candidate Drug Research，Guangzhou 510006，China）

Aim To study the influence of Sodium fer-ulate（SF）on bone metabolism in glucocorticoidin-duced osteoporosis rats.Methods Thirty cases of fe-male Wistar Rats（3-month-old）were divided into con-trol group，model group and SF group（low-dose group，middle-dose group，high-dose group）by ran-domized block design.Double fluorochrome labeling with calcein was performed before necropsy.The left tibia was taken for bone histomorphometry.Results In static parameters，the proximal tibia cancellous bone trabecular thickness，trabecular quantity and area ratio were significantly reduced in model group compared with control group；while compared with model group，those were increased in middle and high-dose SF group.Trabecular separation degree was increased in model group compared with control group，while it was decreased in middle and high-dose SF group compared with model group.In dynamic parameters，the calcula-tion parameters of cancellous bone mark perimeter rate and the bone formation rate were increased in model group compared with control group，in middle and high-dose SF group the bone formation rate was in-creased compared with model group.In bone cells，os-teoclast number per mm，osteoblast number per mm，percent osteoblast surface perimeter and percent osteo-clast surface perimeter were increased in model group compared with control group.In growth-plate，the thickness of growth-plate was increased in model group compared with control group.In bone cells and growth-plate there was no statistical significance between treat-ment group and model group.Conclusion This study demonstrates that SF can increase bone mass and im-prove bone structure，which may be related to the im-provement of bone formation.SF is effective for GIOP in rats.

GIOP；Sodium ferulate；bone histomor-phometry studies；bone cell；growth-plate；bone tra-becula；cancellous bone

時間：2016－2－26 10：20 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.038.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.019

A

1001－1978（2016）03－0394－05

R-332；R323.72；R336；R681.05；R977.11

2015－10－04，

2015－11－24

國家自然科學基金面上項目（No 30971172）；廣東省科技計劃項目（No 2013B060300022）

劉 洋（1989－），女，碩士生，研究方向：骨骼疾病藥理藥效學，Tel：020-39352201，E-mail：15817148003＠139.com；李青南（1956－），女，博士，教授，研究員，研究方向：骨代謝病理生理及藥理藥效學，Tel：020-39352589，E-mail：qingnanli＠sina.com；陸幸妍（1963－），女，副教授，研究方向：骨和骨骼肌代謝性疾病分子機制及藥物靶點發現，通訊作者，Tel：020-39352201，E-mail：xingyanlu2005＠126.com