骨髓間充質干細胞移植治療大鼠肺纖維化的實驗研究

曾省都，張　偉，康秀華

(1．贛南醫學院第一附屬醫院，江西　贛州　341000; 2．南昌大學第一附屬醫院，江西　南昌　330006)

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骨髓間充質干細胞移植治療大鼠肺纖維化的實驗研究

曾省都1，張偉2，康秀華2

(1．贛南醫學院第一附屬醫院，江西贛州341000; 2．南昌大學第一附屬醫院，江西南昌330006)

摘要:目的:探討骨髓間充質干細胞移植對博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化模型肺泡炎和肺纖維化的影響及其可能機制。方法:體外分離、培養SD大鼠骨髓間充質干細胞，傳至第四代用于實驗; 60只SD大鼠隨機分為陰性對照組(N組)、陽性對照組(P組)、地塞米松治療組(D組)和間充質干細胞移植治療組(M組)，每組各15只大鼠。P組、D組和M組分別經氣管注入博萊霉素制備肺纖維化模型。造模后7、14、21天留取肺組織，HE染色觀察肺泡炎和肺纖維化的程度，免疫組化的方法測定肺組織轉化生長因子β1(TGF-β1)的表達。結果:博萊霉素造模后，取肺組織行HE染色，病理符合肺纖維;在處理后的7、14和21天，與P組相比，D、M組大鼠出現肺炎和肺纖維化程度明顯減輕，同時大鼠肺組織中表達轉化生長因子β1(TGF-β1)的陽性細胞數明顯減少(P＜0．05) ;而D、M組在第7、14、21天病理結果及轉化生長因子表達的比較中，組間差異無顯著性。結論:骨髓間充質干細胞移植對博萊霉素誘導大鼠肺纖維化模型的肺泡炎和肺纖維化程度具有一定的抑制作用，作用機制可能與其降低肺組織轉化生長因子(TGF-β1)的表達有關。

關鍵詞:骨髓間充質干細胞;肺纖維化;轉化生長因子(TGF-β1)

特發性肺纖維化(IPF)是一種病因不明、發病機制不清的致命性彌漫性肺間質疾病，其病理特征是肺泡上皮的損傷和成纖維細胞增殖，形成成纖維細胞灶(fibroblastfoci)［1］。美國IPF的患病率為42．7/10萬，每年發病率為16．3/10萬［2］，我國間質性肺疾病的發病率及患病率呈現出逐年上升的趨勢［3］。IPF確診后平均存活期為2～4年，5年生存率為30%～50%［4］。在對肺纖維化的治療上，尚缺乏特效的療法，因此迫切需要找到更切實可行并有實效的治療特發性肺纖維化的方法。

干細胞一族具有自我復制和多向分化潛能的能力，為許多復雜疾病的治療帶來了新的曙光。有報道稱異體骨髓來源的干細胞可以植入并分化為受者各種組織的組成細胞，包括骨、軟骨、脂肪、上皮和內皮等［5］，在治療多器官組織疾病中都被證明有作用。基于上述情況，本實驗就骨髓間充質干細胞移植對肺纖維化的影響進行研究。

1　材料與方法

1．1材料雄性SD大鼠60只，體重(200±50) g;博萊霉素粉劑; DMEM低糖培養基，新生牛血清，胰酶，乙二胺四乙酸，瓊脂糖，抗大鼠TGF-β1試劑等。

1．2方法

1．2．1 MSCs分離與培養無菌條件下取SD雄性大鼠股骨、脛骨，α-MEM培養基沖洗骨髓腔，獲得的細胞懸液轉入離心管，離心，棄上清，細胞沉淀中加入含10%新生牛血清的α-MEM培養基，轉入培養瓶，5%CO2培養箱中培養。換液除去非貼壁細胞，此后每3天換液1次，約80%融合時應用0．125%胰酶+ 0．02% EDTA消化傳代。傳至第四代時MSCs用于實驗。

1．2．2動物模型建立和分組60只SD雌性大鼠隨機分為4組，每組15只。陰性對照組(N組) :第0天用3%戊巴比妥腹腔注射麻醉后，氣管內一次性注射生理鹽水5 mL·kg－1，注藥后立即將大鼠直立、旋轉，使生理鹽水盡量均勻分布，蘇醒后放回籠里繼續飼養，未做任何處理。陽性對照組(P組) :第0天麻醉后氣管內一次性注射博萊霉素5 mg· kg－1，制備博萊霉素致肺纖維化模型，蘇醒后放回籠里繼續飼養。地塞米松組(D組)，造模與P組相同，第2日起每日腹腔注射地塞米松0．5 mg·kg－1，連續7天。間充質干細胞移植組(M組) :造模與P組相同，造模后立即尾靜脈注射間充質干細胞5× 105(PBS 200 μL)。

1．2．3動物標本的收集各組大鼠均于第7、14、21天，分別取5只用3%戊巴比妥注射麻醉，取右肺中葉于中性甲醛中固定，送病理科石蠟包埋，常規切片，HE染色及免疫組化測組織轉化生長因子TGF-β1的表達。

1．2．4病理學檢測在光鏡下觀察大鼠肺組織HE染色病理切片，根據Szapiel等［6］方法確定肺泡炎和肺纖維化程度，標準如下:肺泡炎分4級: (－) :評0分，無肺泡炎。(+ ) :評1分，輕度肺泡炎。(+ + ) :評2分，中度肺泡炎。(+ + + ) :評3分，重度肺泡炎。肺纖維化分4級: (－) :評0分，無纖維化。(+ ) :評1分，輕度纖維化。(+ + ) :評2分，中度纖維化。(+ + + ) :評3分，重度纖維化。

2　結果

2．1 MSC的分離與培養MSCs原代培養于接種后第2天出現貼壁細胞，以成纖維樣細胞在數量上占絕對優勢并逐漸形成集落。此外，在培養物中還可見少量圓形、透亮的造血干細胞、多核巨噬細胞及單核細胞，隨著換液被除去而逐漸減少。原代細胞80%融合時進行傳代，2～3代后MSCs變得較為同質，大小較均勻(圖1a、b)。

圖1　間充質干細胞

2．2肺泡炎嚴重度評分從表1可見，在肺泡炎嚴重度評分中，P組、D組及M組于造模后第7、14、21天均較N組重，以第7天最重，隨后逐漸減輕，差異有顯著性; D、M組分別與P組比，肺泡炎嚴重程度減輕，于造膜后第7天、14天差異有顯著性(P＜0．05)，隨著炎癥的減輕，在造膜后21天，三者間差異無顯著性; D、M兩組比較在造膜后第7天、14天及21天差異無顯著性(P＞0．05)。

表1肺泡炎嚴重度評分/±s

表1肺泡炎嚴重度評分/±s

注:與P組比較，* P﹤0．05;與D組比較，▲P＞0．05。

組別n　7 d　14 d　21 d N　 5　 0．2±0．45　 0±0　0±0 P　 5　 2．8±0．45　 2．0±0．71　 1．4±0．55 D　 5　 1．8±0．45*　1．2±0．45*1．2±0．45 M　 5　 1．6±0．55＊▲1．2±0．45＊▲1．0±0▲

2．3肺纖維化嚴重度評分從表2可見，在肺纖維化評分中，P組、D組及M組于造模后第7、14、21天高于N組，以第21天最重(P＜0．05) ; P組與D、M組比，于造膜后14天、21天，兩者差異有顯著性(P ﹤0．05) ; D、M兩組間比較差異無顯著性(P＞0．05)。

表2肺纖維化嚴重度評分/±s

表2肺纖維化嚴重度評分/±s

注:與P組比較，* P﹤0．05;與D組比較，▲P＞0．05。

組別n　7 d　14 d　21 d N　 5　 0±0　0±0　0±0 P　 5　 0．6±0．55　 2．2±0．45　 2．6±0．55 D　 5　 0．2±0．45　 1．2±0．45*　1．4±0．55*M　 5　 0．4±0．55　 1．2±0．45＊▲1．4±0．55＊▲

2．4大鼠肺組織中TGF-β1表達大鼠肺組織TGF-β1蛋白表達在胞漿，呈黃色或棕黃色顆粒，主要定位于肺泡巨噬細胞胞漿中。以細胞胞漿、胞膜、細胞外基質染為棕色為陽性;每張切片選取5個視野，計陽性細胞數/高倍視野(表3)。

從表3可見，肺組織中TGF-β1表達在P組、D組及M組于造模7、14、21天顯著高于N組，差異有顯著性，于7天時達高峰值;與P組比，D、M組于造膜后7、14、21天陽性細胞數均減少，兩者差異有顯著性(P﹤0．01，P﹤0．05) ; D、M兩組間在7、14、21天陽性細胞比，差異無顯著性(P＞0．05)。

表3各組各時間段TGF-β1表達陽性巨噬細胞數/陽性細胞數/高倍視野，±s

表3各組各時間段TGF-β1表達陽性巨噬細胞數/陽性細胞數/高倍視野，±s

注:與P組比較* P﹤0．01，△P﹤0．05; 與D組比較，▲P＞0．05。

組別n　TGF-β1陽性細胞數7 d　14 d　21 d N　 5　 1．12±0．39　 1．04±0．17　 1．16±0．17 P　 5　 16．96±1．23　 13．76±2．38　 10．20±1．75 D　 5　 12．72±1．38*　9．92±1．92△　7．24±1．58△M　 5　 11．98±2．37＊▲9．60±1．05△▲6．68±1．27△▲

結果顯示，博萊霉素處理大鼠的肺組織TGF-β1表達明顯、范圍廣;特別是在第7天肺泡腔和間質中出現大量的TGF-β1強陽性的肺泡巨噬細胞，肺組織中TGF-β1陽性的肺泡巨噬細胞，可以單個或成群肺泡巨噬細胞出現，第14～21天時在肺泡腔和間質中TGF-β1陽性的肺泡巨噬細胞逐漸減少。提示表達TGF-β1蛋白的肺泡巨噬細胞在急性肺泡炎期明顯增加，對肺纖維化的發生和發展可能起重要的作用(圖2～5)。

圖2　陰性對照組正常肺巨噬細胞轉化生長因子表達(HE×200)

圖3　陽性對照組第7、14及21天肺組織轉化生長因子表達情況(HE×400)

圖4　激素治療組第7、14及21天肺組織轉化生長因子表達情況(HE×400)

圖5　骨髓間充質干細胞移植組第7、14及21天肺組織轉化生長因子表達情況(HE×400)

3　討論

轉化生長因子-β1(Transformating Growth Factorbeta1，TGF-β1)是迄今為止發現最強的促纖維化因子。TGF-β1對上皮細胞生長有抑制活性，促進纖維母細胞、平滑肌細胞的生長［7－8］。因此通過抑制TGF-β1的表達來阻止由炎癥引起的肺纖維化治療方法在不斷的研究中。

研究結果發現，在大鼠肺纖維化模型造模同時即給予骨髓間充質干細胞移植干預，與P組比，其肺組織肺泡炎及纖維化的程度顯著減輕;與激素治療組(D組)比，在病理切片上可見，干細胞移植組略比激素治療組病灶稍輕，效果似乎更好。與陽性對照組比較，在造膜后第7、14、21天肺組織表達轉化生長因子TGF-β1的陽性細胞數減少(P﹤0．05)，這表明，肺泡炎與肺纖維化減輕，可能與干細胞抑制肺巨噬細胞表達TGF-β1有關。

本研究主要探討并比較了骨髓干細胞移植組(M)與激素治療組(D)組對博萊霉素導致肺纖維化的治療作用及可能機制。從結果中我們可以看出兩種治療方法中存在細微的差別:在免疫組化測定中，兩者TGF-β1表達強陽性的肺巨噬細胞的數量都比陽性對照組(P)減少，提示兩者在抑制肺纖維化的機制中有相同之處，也就是說都有通過抑制TGF-β1的表達，減緩肺纖維化的進展過程。這種不顯著的差別提示，骨髓干細胞移植組(M)對博萊霉素誘導肺纖維化大鼠肺組織TGF-β1的抑制作用可能比激素治療組(D)的效果較好，也可能是骨髓間充質干細胞移植組(M)對抑制肺纖維化的機制比地塞米松治療組(D)更為復雜，它通過表達或抑制其它的生長因子或分化為Ⅱ型肺泡上皮細胞甚至直接分化為Ⅰ型肺泡上皮細胞完成的。當然，至于骨髓干細胞移植組(M)通過何種途徑抑制轉化生長因子的表達以及如何分化為肺泡上皮細胞的機制尚不清楚，值得進一步研究。

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Experimental Study of Mesenchymal Stem Cell Transplantation in the Treatment of Bleomycin-induced Pulmonary Fibrosis in Rats

ZENG Xing-du1，ZHANG Wei2，KANG Xiu-hua2
(1．The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou，Jiangxi 341000;
2．The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330006)

Abstract:Objective: To investigate the effects of mesenchymal stem cells transplatation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats and to study the mechanism of its effects．Methods: Bone marrow MSC were harvested from male SD rats in vitro and spread to the fourth generation for the experiment．60 SD rats were randomly divided into 4 groups of 15: negative control group (Group N)，positive control group (Group P)，mesenchymal stem cells grafting group(group M) and dexamethasone treated group (Group D)．Group P，Group D and group M were made as pulmonary fibrosis models by intratracheal instillation of bleomycin．The rats were sacrificed at day 7，14，21 after modeling in batch．Lung tissues were restored to analyze the pathological changes．The content of transforming growth factor-β1(TGF-β1) was measured by using immunohistochemistry．Results: After induced by bleomycin solutions，the lung tissue was obtained and stained by HE，the pathological changes were in accordance with pulmonary fibrosis．On the 7th，14th and 21st day after treatment，the pulmonary inflammation and fibrosis extent of group D and M rats decreased obviously compared with group P．Meanwhile，the growth factor-β1(TGF-β1) positive cells in lung tissue of group D and M decreased more significantly than group P，and this shows significant difference between each group．But there is no significant difference between group D and M．Conclusions: mesenchymal stem cells grafting could decrease alveolitis and pulmonary fibrosis in rats with bleomycin-induced pulmonary fibrosis，the mechanism might be related to its decreasing expression of TGF-β1．

Key Words:mesenchymal stem cells; pulmonary fibrosis; transforming growth factor-β1

(收稿日期:2015－05－08) (責任編輯:敖慧斌)

DOI:10．3969/j．issn．1001－5779．2016．01．005

中圖分類號:R457．7

文獻標志碼:A

文章編號:1001－5779(2016) 01－0020－05