慢病毒介導siRNA沉默ERK2對創(chuàng)傷性骨性關節(jié)炎大鼠軟骨退變的影響及其機制

寧仁德，孔令超，周業(yè)金，王祥

(1安徽醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院，合肥230031；2上海交通大學醫(yī)學院附屬第三人民醫(yī)院)

·論著·

慢病毒介導siRNA沉默ERK2對創(chuàng)傷性骨性關節(jié)炎大鼠軟骨退變的影響及其機制

寧仁德1，孔令超1，周業(yè)金1，王祥2

(1安徽醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院，合肥230031；2上海交通大學醫(yī)學院附屬第三人民醫(yī)院)

目的 觀察慢病毒介導siRNA沉默細胞外信號調節(jié)激酶2(ERK2)對創(chuàng)傷性骨性關節(jié)炎大鼠軟骨退變的影響，并探討其機制。方法 將30只右膝創(chuàng)傷性骨性關節(jié)炎大鼠隨機分為三組，每組10只，分別于右膝關節(jié)腔注射無菌PBS(模型組)、ERK2 siRNA陰性慢病毒溶液(對照組)及ERK2 siRNA慢病毒溶液(觀察組)。8周后處死大鼠，取其右膝關節(jié)觀察膝關節(jié)軟骨形態(tài)并進行評分，行HE、甲苯胺藍及番紅“O”染色后觀察軟骨組織病理形態(tài)，采用Mankin半定量法進行關節(jié)軟骨評分。采用Real-time PCR法檢測各組軟骨組織MMP3、MMP13及Col2a mRNA相對表達量。結果 觀察組軟骨面潰瘍、缺損程度均輕于模型組和對照組。HE、甲苯胺藍、番紅“O”染色均顯示，觀察組軟骨面較光滑，裂隙出現、表面組織丟失、基質染色減輕、軟骨細胞增生和排列紊亂程度均輕于模型組和對照組。模型組、對照組軟骨形態(tài)評分、關節(jié)軟骨評分均高于觀察組(P均<0.05)，模型組和對照組比較無統計學差異(P均>0.05)。觀察組MMP3、MMP13 mRNA相對表達量均低于模型組和對照組，Col2a mRNA相對表達量均高于模型組和對照組(P均<0.01)；模型組和對照組MMP3、MMP13及Col2a mRNA相對表達量比較無統計學差異(P均>0.05)。結論 慢病毒介導siRNA沉默ERK2能夠減輕創(chuàng)傷性骨性關節(jié)炎大鼠的軟骨退變，機制可能與降低MMP3、MMP13表達及增加Col2a表達有關。

骨性關節(jié)炎；軟骨退變；慢病毒；小干擾RNA；細胞外信號調節(jié)激酶2；大鼠

骨性關節(jié)炎是最常見的關節(jié)疾病，關節(jié)創(chuàng)傷后發(fā)生的骨性關節(jié)炎占12%，其發(fā)病機理尚未完全明確[1，2]。研究表明，創(chuàng)傷性骨性關節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展與多種細胞炎性因子的調控密切相關，如IL-1β和TNF-α等[3]。RNA干擾是由雙鏈RNA誘發(fā)的導致同源mRNA高效特異性降解的一種基因沉默現象，能夠快速、有效地阻斷相應基因的表達[4]。直接轉染合成的小干擾RNA(siRNA)亦能阻斷相應基因表達，但存在體內容易降解的缺點[5]。慢病毒載體技術是近年發(fā)展起來的，其介導的siRNA能夠穩(wěn)定、持久和高效地阻斷相應基因表達，目前已證實其在骨性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎和假體周圍骨溶解等許多關節(jié)疾病的治療方面具有重要價值[6～8]。2014年10月～2015年5月，本研究參照前期試驗的方法[5]，構建和包裝慢病毒介導沉默大鼠細胞外信號調節(jié)激酶2(ERK2)基因的siRNA，觀察其對創(chuàng)傷性骨性關節(jié)炎大鼠軟骨退變的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性Wistar大鼠30只，12周齡，體質量180～200 g，購于上海實驗動物研究中心。人胚腎293T細胞(上海生命科學院)。TRIzol試劑、Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)，SYBR Green Ⅰ Real-time PCR 試劑盒、反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)，DMEM、胎牛血清(美國Gibco公司)，攜帶綠色熒光蛋白的慢病毒載體系統(pshRNA-H1-Luc質粒，上海吉凱基因公司)。7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，低溫超速離心機(美國BD公司)，熒光倒置顯微鏡(IX51型，日本Olympus公司)。

1.2 ERK2 siRNA慢病毒載體的轉染及滴度測定 參照前期試驗方法[5]，體外構建大鼠ERK2 siRNA慢病毒載體，并對慢病毒進行包裝。大鼠ERK2 siRNA序列：5′-GCACCTCAGCAATGATCAT-3′，ERK2 siRNA陰性對照序列：5′-TGCAGTTCGGAATCAGCTT-3′。體外合成后，通過攜帶綠色熒光蛋白的pshRNA-H1-Luc質粒構建慢病毒載體，取對數生長期的人胚腎293T細胞進行慢病毒包裝。取感染復數(MOI)為10、25、50的慢病毒載體濃縮液轉染人胚腎293T細胞，熒光倒置顯微鏡下觀察轉染情況。鏡下可明顯觀察到293T細胞內有綠色熒光，表明慢病毒載體成功轉染293T細胞。當MOI為10、25、50時，其轉染率分別為60%、75%、90%。以MOI為50時的慢病毒載體濃縮液進行轉染，制備慢病毒溶液，經系列稀釋法計算出ERK2 siRNA慢病毒及其陰性慢病毒的滴度。ERK2 siRNA慢病毒滴度為1×108tu/mL，ERK2 siRNA陰性慢病毒滴度為0.5×109tu/mL，將慢病毒溶液置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 模型制作與分組處理 將30只大鼠分籠飼養(yǎng)，0.5%水合氯醛按0.35 g/100 g體質量腹腔內注射麻醉。參照Baragi等[9]的方法，選擇右膝關節(jié)制備創(chuàng)傷性骨性關節(jié)炎模型：于無菌狀態(tài)下行髕骨外側旁切口暴露右膝關節(jié)，切除內側半月板，縫合關節(jié)囊與皮膚，關閉切口。手術后不固定肢體，肌注青霉素20萬U/d，連用3 d。術后1周，將30只大鼠隨機分為模型組、對照組和觀察組，各10只。無菌條件下取21號無菌注射針行右膝髕骨旁穿刺，進行關節(jié)腔內藥物注射。模型組注射0.1 mL無菌PBS，對照組注射0.1 mL ERK2 siRNA陰性慢病毒溶液，觀察組注射0.1 mL ERK2 siRNA慢病毒溶液。注射后適當伸屈膝關節(jié)5 min，使注射液體均勻分布于膝關節(jié)腔。

1.4 相關指標觀察

1.4.1 軟骨退變情況 各組注射后第8周，處死大鼠，取右膝關節(jié)。首先觀察右膝關節(jié)軟骨形態(tài)，參照董剛等[10]的方法進行軟骨形態(tài)評分。切取右股骨內側髁軟骨組織，生理鹽水沖洗后依次行4%甲醛固定、甲酸-甲醛脫鈣、梯度乙醇脫水，封蠟后制成軟骨組織切片。分別行HE、甲苯胺藍及番紅“O”染色，于50倍光鏡下觀察關節(jié)軟骨組織病理形態(tài)，番紅“O”染色后采用Mankin半定量法進行關節(jié)軟骨評分[11]。

1.4.2 軟骨組織基質金屬蛋白酶3(MMP3)、MMP13及Ⅱ型膠原酶(Col2a)mRNA表達 采用Real-time PCR法檢測。取大鼠右股骨內側髁退變區(qū)軟骨組織，根據TRIzol試劑盒說明提取總RNA，逆轉錄后合成cDNA第一鏈。逆轉錄反應體系：5×M-MLV逆轉錄酶緩沖液5 μL，M-MLV逆轉錄酶1 μL，dNTP 2 μL，RNAase抑制劑0.5 μL，Oligdt 2 μL，加入DEPC去離子水補至20 μL。充分混勻后42 ℃反應60 min，75 ℃持續(xù)15 min滅活逆轉錄酶，cDNA鏈合成后-20 ℃?zhèn)溆谩⒄誗o等[12]的方法設計MMP3、MMP13、Col2a及內參基因β-actin的上下游引物，見表1。PCR反應體系：SYBR GreenⅠ混合物10 μL,上、下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補至25 μL。置入Prism 7500熒光定量PCR儀，設定擴增程序：95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，62 ℃ 20 s，重復35個循環(huán)。每個樣品重復3次且設置3個平行孔。目的基因mRNA相對表達量以2-ΔΔCt表示。

表1 MMP3、MMP13、Col2a及內參基因β-actin引物序列

2 結果

2.1 各組軟骨退變情況比較 各組右膝關節(jié)內側脛骨平臺均較外側退變嚴重，其中模型組和對照組膝關節(jié)軟骨面無光澤，潰瘍明顯，缺損深達軟骨深層，部分可見軟骨剝脫，有骨贅形成；觀察組膝關節(jié)軟骨面欠光滑，光澤稍灰暗，部分區(qū)域軟骨面毛糙有糜爛，有少量骨贅形成。模型組軟骨形態(tài)評分為(3.50±0.55)分，對照組為(3.33±0.52)分，觀察組為(2.50±0.55)分；模型組、對照組均高于觀察組(P均<0.05)，模型組和對照組比較無統計學差異(P均>0.05)。

HE染色可見，模型組和對照組軟骨面大部分區(qū)域粗糙不平滑，基質染色明顯且不均勻，軟骨細胞排列嚴重紊亂，組織重度增生，潮線模糊；觀察組軟骨面部分區(qū)域不光滑，基質染色、軟骨細胞排列紊亂程度、組織增生程度均明顯輕于模型組和對照組，潮線隱約可見。

甲苯胺藍染色可見，模型組和對照組關節(jié)表面軟骨組織丟失明顯，軟骨面較多區(qū)域可見裂隙，軟骨細胞增多，基質染色明顯減輕且不均勻；觀察組關節(jié)表面軟骨組織輕度丟失，軟骨面部分區(qū)域可見裂隙，軟骨細胞輕度增生，基質染色輕于模型組和對照組。

番紅“O”染色可見，模型組和對照組軟骨面明顯粗糙不平，較多區(qū)域連續(xù)性中斷，軟骨細胞排列紊亂且染色不明顯，部分潮線可見血管穿過；觀察組軟骨面輕度粗糙，少許區(qū)域連續(xù)性中斷，軟骨細胞排列輕度紊亂，基質染色較輕。模型組關節(jié)軟骨評分為(12.50±1.05)分，對照組為(12.33±1.21)分，觀察組為(7.33±1.03)分；模型組、對照組均高于觀察組(P均<0.05)，模型組和對照組比較無統計學差異(P>0.05)。

2.2 各組軟骨組織MMP3、MMP13及Col2a mRNA表達比較 觀察組MMP3、MMP13 mRNA相對表達量均低于模型組和對照組，Col2a mRNA相對表達量均高于模型組和對照組(P均<0.01)；模型組和對照組MMP3、MMP13及Col2a mRNA相對表達量比較無統計學差異(P均>0.05)。見表1。

表1 各組軟骨組織MMP3、MMP13及Col2a mRNA表達比較(相對表達量

注：與模型組比較，*P<0.01；與對照組比較，#P<0.01。

3 討論

關節(jié)創(chuàng)傷后形成骨性關節(jié)炎的病理過程涉及眾多因素，目前其確切的發(fā)生機理尚未完全明確[12]。研究表明，細胞炎性因子在創(chuàng)傷性骨性關節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用，關節(jié)創(chuàng)傷后其關節(jié)液IL-1β水平顯著升高，而IL-1β目前被認為是導致關節(jié)軟骨退變和破壞的最重要的細胞因子之一[3,13]。前期試驗顯示，ERK2通路是IL-1β誘導軟骨細胞分泌MMP3、MMP13，并抑制Col2a表達的一個重要信號轉導通路[9]。研究顯示，MMP13能夠分解軟骨基質中的Ⅱ型膠原酶，MMP3可降解軟骨組織細胞外基質成分，如纖維連接蛋白和層粘連蛋白。而關節(jié)軟骨組織中Ⅱ型膠原酶、纖維連接蛋白以及層粘連蛋白等對于維持正常軟骨組織的修復重建和新陳代謝十分重要，如果這些成分發(fā)生異常，將會嚴重影響軟骨組織的新陳代謝平衡，最終可導致關節(jié)軟骨組織的退變和破壞[14，15]。

關節(jié)創(chuàng)傷后發(fā)生的骨性關節(jié)炎早期臨床表現與傳統骨性關節(jié)炎明顯不同，當其發(fā)展到伴隨關節(jié)疼痛、畸形等傳統骨性關節(jié)炎典型的臨床表現時，患者一般處于骨性關節(jié)炎的晚期，此時可采取的外科手段只能是關節(jié)置換、截骨和融合等方式[3,14]。針對創(chuàng)傷后激活關節(jié)軟骨退變和破壞的信號轉導機制，在不同時間點采取特別干預信號轉導措施來控制其演變，可能成為預防和治療其發(fā)生和發(fā)展的方向[3,14]。早期研究顯示，一些能夠導致軟骨細胞死亡、控制炎癥因子釋放和蛋白多糖丟失等的小分子物質，能夠明顯減少軟骨細胞死亡，修復破損的軟骨細胞膜，清除氧自由基，從而延緩創(chuàng)傷后骨性關節(jié)炎的炎性發(fā)展過程，但此類小分子物質具有易降解、持續(xù)效果時間短等不足[16，17]。

慢病毒載體技術是近年發(fā)展起來的一項新技術，具有轉染率高、在傳代和靜止期細胞中表達穩(wěn)定的特性，而慢病毒載體介導的siRNA能夠穩(wěn)定、持久和高效地阻斷相應基因的表達[6]。本研究參考以往的研究[10]，切除大鼠內側半月板制備大鼠創(chuàng)傷性骨性關節(jié)炎動物模型，并于其膝關節(jié)腔內注射前期構建包裝好的慢病毒介導的ERK2 siRNA，觀察沉默ERK2基因后對創(chuàng)傷性骨性關節(jié)炎軟骨退變的影響。結果顯示，觀察組軟骨面潰瘍、缺損程度均輕于模型組和對照組。HE、甲苯胺藍、番紅“O”染色均顯示觀察組軟骨面較光滑，裂隙出現、表面組織丟失、基質染色、軟骨細胞增生和排列紊亂程度均輕于模型組和對照組。模型組、對照組軟骨形態(tài)評分、關節(jié)軟骨評分及MMP3、MMP13 mRNA相對表達量均明顯高于觀察組，Col2a mRNA相對表達量均明顯低于觀察組，而模型組、對照組上述指標比較無明顯統計學差異。

綜上所述，慢病毒介導siRNA沉默ERK2能夠減輕創(chuàng)傷性骨性關節(jié)炎大鼠的軟骨退變，機制可能與降低MMP3、MMP13表達及增加Col2a表達有關。本研究為未來臨床基因治療創(chuàng)傷性骨性關節(jié)炎提供了一個新的藥物治療靶點，值得借鑒。

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Effect of siRNA mediated by lentivirus silencing ERK2 on cartilage degeneration in rat models of post traumatic osteoarthritis and its mechanism

NINGRende1,KONGLingchao,ZHOUYejin,WANGXiang

(1TheThirdAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230031,China)

Objective To observe the effect of siRNA mediated by lentivirus silencing extracellular signal-regulated kinase 2 (ERK2) on cartilage degeneration in rat models of post-traumatic osteoarthritis and to investigate its mechanism. Methods Thirty light knees of traumatic osteoarthritis model rats were randomly divided into 3 groups with 10 rats in each group, then the right knee joint cavities of theirs were injected with sterile PBS (PBS group), negative ERK2 siRNA lentivirus solution (negative control group) and ERK2 siRNA lentivirus solution (observation group), respectively. After 8 weeks, the rats were sacrificed and the general morphology of the articular cartilage was observed and scored, then the articular cartilage pathological changes were observed under the optical microscope with HE, toluidine blue and safranin "O" staining, respectively, and the degree of cartilage degeneration was analyzed by Mankin semi-quantitative method. Meanwhile, the relative mRNA expression of matrix metalloproteinase 3 (MMP3), MMP13 and Col2a of cartilage tissues was analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. Results The articular cartilage surface ulcers and defects in the observation group were significantly lighter than those of the PBS group and negative control group, the extent of smooth articular surface of cartilage, crack area, loss of tissue, matrix staining, the proliferation of chondrocytes and the disorder of arrangement in the cartilage tissues of the observation group were lighter than those of the PBS group and negative control group; and the normal morphology and articular cartilage score in the observation group were significantly lower than those in the PBS group and negative control group (allP<0.05), there was no significant difference between the PBS and negative control groups (P>0.05). In addition, the relative mRNA expression levels of MMP3 and MMP13 in the observation group were lower than those in the PBS group and negative control group, while the relative mRNA expression level of Col2a was higher than that in the PBS group and negative control group (allP<0.01); there was no significant difference in the expression of MMP3, MMP13 and Col2a mRNA between the PBS group and negative control group (allP>0.05). Conclusion siRNA mediated by lentivirus silencing ERK2 can significantly reduce the cartilage degeneration of post-traumatic osteoarthritis, whose mechanism may be related with the decreased expression of MMP3 and MMP13 and increased expression of Col2a.

osteoarthritis; cartilage degeneration; lentivirus; small interfering RNA; extracellular signal-regulated kinase 2; rats

國家自然科學基金資助項目(81101380)。

寧仁德(1972-)，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向為骨與關節(jié)損傷。E-mail： nrd192@qq.com

王祥(1978-)，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向為骨與關節(jié)損傷。E-mail： doctorwangxiang@sohu.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.001

R684.3

A

1002-266X(2016)16-0001-04

2015-10-21)