人肺腺癌A549細胞上清液對人臍靜脈內皮細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

曹月誠，羨海英 ，陳登峰，吳剛

(1衡水市哈勵遜國際和平醫院，河北衡水053000；2中國醫科大學附屬第一醫院)

人肺腺癌A549細胞上清液對人臍靜脈內皮細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

曹月誠1，羨海英1，陳登峰1，吳剛2

(1衡水市哈勵遜國際和平醫院，河北衡水053000；2中國醫科大學附屬第一醫院)

目的 探討人肺腺癌A549細胞上清液對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)增殖、遷移和侵襲能力的影響。方法 取對數生長期HUVECs，分別加入培養24、48 h的A549細胞上清液(分別記為 24 h組和 48 h組)，對照組僅加入高糖DMEM培養基。采用MTS法檢測各組細胞增殖活性，Transwell試驗檢測各組細胞遷移及侵襲能力。結果 與對照組比較，24 h組和 48 h組HUVECs增殖、遷移和侵襲能力均升高，且24 h組升高更明顯(P<0.05或<0.01)。結論 A549細胞上清液可增強HUVECs的增殖、遷移和侵襲能力，以培養24 h的A549細胞上清液作用較強。

人臍靜脈內皮細胞；人肺腺癌A549細胞；增殖；遷移；侵襲

腫瘤細胞的生長、轉移需要大量的營養物質，這些營養物質均由血管提供[1]。內皮細胞完成遷移、降解基質、侵襲并形成新生的血管，這一系列過程不僅受全身神經體液的影響，同樣也受其所處微環境的調控[2, 3]。癌細胞分泌的各類因子會影響其周圍的內皮細胞，使其向腫瘤組織的方向生長，完成萌芽期和發育期。腫瘤組織一旦與毛細血管接觸，就會快速增生甚至轉移至其他部位[4]。2013年1月～2014年10月，本研究觀察不同時段人肺腺癌A549細胞上清液對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)增殖、遷移和侵襲能力的影響?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌A549細胞及HUVECs均購自中國醫學科學院細胞中心。高糖DMEM培養基、FBS、0.25% EDTA胰酶、雙抗均購自美國Gibco公司，細胞增殖和毒性檢測試劑盒購自美國Promega公司，Transwell培養板購自美國Corning公司。

1.2 細胞培養 采用含10% FBS、1%雙抗的高糖DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養A549細胞及HUVECs，2～3天換液，至80%～90%融合時傳代培養，取對數生長期細胞進行研究。

1.3 不同時段A549細胞上清液制備 取對數生長期A549細胞接種在10 cm2培養皿中，采用含10% FBS、1%雙抗的高糖DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，2～3天換液。至90%融合時，換10 mL的無血清DMEM培養基分別培養24、48 h。收集上清液，2 000 r/min離心10 min，去除死細胞及雜質，濾器過濾，-80 ℃保存備用。

1.4 細胞分組與處理 取饑餓處理后的HUVECs以5 000/孔密度接種于96孔板中，分別加入含5% FBS的培養24 h A549細胞上清液(24 h組)、48 h A549細胞上清液(48 h組)和高糖DMEM培養基(對照組)，培養24 h。

1.5 相關指標觀察

1.5.1 細胞增殖活性 采用MTS法。按照MTS細胞增殖和毒性檢測試劑盒說明書操作，取對數生長期的各組細胞，將100 μL MTS加入各組孔板中，孵育4 h，495 nm測定各孔吸光度值。計算細胞增殖活性，每組設5個復孔。

1.5.2 細胞遷移能力 采用Transwell遷移試驗。取對數生長期的HUVECs，0.25%胰酶消化后1 000 r/min離心5 min，采用含1% FBS的DMEM培養基懸浮HUVECs，均勻接種在Transwell培養板上室，每個小室2×104個細胞。下室內分別為含有20% FBS的培養24 h、48 h A549細胞條件培養基和對照DMEM培養基，分別記為24 h組、48 h組和對照組。16 h后取出上室，使用棉簽小心擦除膜上面的細胞，90%乙醇固定20 min，0.1%龍膽紫染色15 min。鏡下觀察，隨機計數5個視野下的細胞數，取平均值。

1.5.3 細胞侵襲能力 采用Transwell侵襲試驗。上室加入稀釋Matrigel膠(1∶5 DMEM稀釋)50 μL，放入培養箱2 h以上，凝固待用。取對數生長期的HUVECs，參照1.5.2的方法均勻接種在預先處理好的Transwell板上室，每個小室5×104個細胞。下室內分別為含有20% FBS的培養24 h、48 h A549細胞條件培養基和對照DMEM培養基，分別記為24 h組、48 h組和對照組。24 h后取出上室，使用棉簽小心擦除膜上面的細胞，90%乙醇固定20 min，0.1%龍膽紫染色15 min。鏡下觀察，隨機計數5個視野下的細胞數，取平均值。

2 結果

與對照組比較，24 h組和48 h組HUVECs增殖、遷移和侵襲能力均升高，且24 h組升高更明顯(P<0.05或<0.01)。見表1。

表1 三組細胞增殖、遷移和侵襲能力比較

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01；與48 h組比較，△P<0.05，▲P<0.01。

3 討論

腫瘤細胞可以通過自分泌和旁分泌的方式產生大量的生長因子，作用于本身或鄰近細胞，從而引起本身或鄰近細胞的應答，造成腫瘤細胞增殖、新生血管形成以及免疫應答減弱等[5]。由于血管生成在腫瘤的侵襲、轉移中發揮了重要作用，故以腫瘤血管為目標的抗血管生成治療成為抗腫瘤研究的熱點[6]。體外研究表明，腫瘤細胞分泌的上清液可以產生多種作用。肖衡等[7]研究發現，肝癌細胞分泌的上清液可以使成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，有利于腫瘤基質的形成，并能促進血管的生長。牛云等[8]發現，腦膠質瘤細胞上清液可以誘導骨髓間充質干細胞向神經元方向分化。

肺癌病死率居各種惡性腫瘤之首[8]。A549細胞系不但是體外研究Ⅱ型肺泡上皮細胞藥物代謝的模式細胞,也是體外研究肺腺癌治療效果的常用細胞。研究發現，A549細胞上清液不但可以影響樹突狀細胞的增殖，降低機體對腫瘤的免疫殺傷作用；也可以誘導基質細胞轉化為更利于腫瘤血管生成的肌成纖維細胞，最重要的是可以直接作用于內皮細胞而促進血管生成，從而為腫瘤的生長轉移提供營養支持[9]。

遷移是細胞從不利于生長的環境向有利于生長的環境轉移的化學趨向性，侵襲是細胞分泌基質金屬蛋白酶等酶類以分解組織基質的能力，二者都是內皮細胞形成血管的必備能力。有報道顯示，HUVECs與腫瘤細胞上清液混合培養的生長環境類似于細胞在人體腫瘤內的生長環境[10]。本研究結果發現，與對照組比較，24 h組和48 h組HUVECs增殖、遷移和侵襲能力均升高，且24 h組升高更明顯；說明A549細胞上清液可增強HUVECs增殖、遷移和侵襲能力，以培養24 h的A549細胞上清液作用較強。分析原因，可能是A549細胞可以分泌大量的生長因子，如血管內皮生長因子、粒細胞集落刺激生長因子、成纖維細胞生長因子等，可以促進血管的生成。

綜上所述，A549細胞上清液可增強HUVECs的增殖、遷移和侵襲能力，以培養24 h的A549細胞上清液作用較強，但是其具體機制仍有待于進一步研究。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.010

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