奧拉西坦對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后RGMa的表達①

丁蘭蘭，王顯鶴，劉喜鳳，楊占雙，吳祥紅，王　嬌，聶　影

(1.佳木斯大學，黑龍江佳木斯154007; 2.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江佳木斯154003)

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奧拉西坦對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后RGMa的表達①

丁蘭蘭1，王顯鶴2，劉喜鳳1，楊占雙2，吳祥紅2，王嬌2，聶影2

(1.佳木斯大學，黑龍江佳木斯154007; 2.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江佳木斯154003)

摘要:目的:通過建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic－－ischemic brain damage，HIBD)模型，檢測HIBD大鼠腦組織中排斥導向因子A(RGMa)的表達變化，探討奧拉西坦對HIBD大鼠RGMa表達的影及其對神經損傷的修復及保護作用。方法:將135只新生7d齡Wistar大鼠隨機分為假手術組(sham組，45只)，缺氧缺血組(HIBD組，45只)和奧拉西坦治療組(45 只)，每組分為12h、24h、48h、72h、7d五個亞組。sham組只做左側頸總動脈分離，不做缺氧處理，HIBD組及奧拉西坦組做左側頸總動脈結扎及缺氧處理，分別于術后腹腔注射生理鹽水0.1mL/kg和奧拉西坦100mg/kg，分別于術后12h、24 h、48 h、72 h、7d斷頸處死大鼠。免疫組化檢測皮質及海馬中RGMa表達。結果: sham組，可見RGMa有微量表達，各組間無統計學意義; HIBD組: RGMa陽性細胞在造模12h開始表達，24h升高，48h達高峰，此后逐漸降低，與sham組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，奧拉西坦治療組各時間點RGMa表達均低HIBD組，差異有統計學意義(P＜0.05)，HIBD組和奧拉西坦治療組陽性細胞數均多于sham組，差異具有統計學意義(P＜0.05)。結論: HIBD時腦組織中RGMa表達增多，參與腦損傷，奧拉西坦能通過抑制RGMa大量表達從而促進受損神經的再生與修復。

關鍵詞:缺氧缺血性腦損傷;奧拉西坦; RGMa

HIBD是新生兒窒息后產生的一種嚴重并發癥，迄今仍是導致新生兒死亡和永久性神經系統后遺癥的原因。HIBD后中樞神經系統(CNS)損傷后神經元再生困難，主要是因為軸突生長抑制因子妨礙了受損神經的的再生，RGMa(Repulsive guidance molecule )是一種新的具有排斥及誘導生長錐塌陷的軸突再生抑制蛋白。本課題是利用新生大鼠HIBD模型來探奧拉西坦對RGMa的影響及其對神經再生的促進作用。

1　材料與方法

1.1材料

清潔級7d齡Wistar新生大鼠，體重(12.5± 3) g，雌雄不限，均由佳木斯大學動物實驗中心提供，奧拉西坦注射液購自哈爾濱三聯藥業股份有限公司，RGMa購自北京博奧森生物工程有限公司，免疫組化試劑盒，DAB顯示劑購于武漢博士德生物工程有限公司;混合氣體(氮氣: 920mL/L，氧氣: 80mL/L) :佳木斯市金鼎氧氣。

1.2分組與造模

將135只新生7d齡Wistar大鼠按隨機數字表法分3組，假手術組(sham組)，缺氧缺血組(HIBD 組)，奧拉西坦治療組，每組45只，每組再分為12h、24h、48h、72h、7d六個亞組。Sham組只做左側頸總動脈分離，不做結扎。HIBD組和奧拉西坦組參照Rice法建立HIBD模型，新生鼠乙醚吸入麻醉，仰臥膠布固定于手術板上，常規酒精消毒。于頸部正中縱行切口，用玻璃分針鈍性分離皮下組織和肌肉，游離并暴露左側頸總動脈后，用4－0號線結扎，縫合切口，碘伏消毒局部皮膚后，返回母鼠身邊恢復1h后，置于自制37°恒溫缺氧倉內，以2L/min的速度輸入含92%氮氣和8%氧氣的混合氣體，持續2h。HIBD組和奧拉西坦組分別于術后10min腹腔注射生理鹽水0.1mL/kg和奧拉西坦100mg/kg，之后每日一次，分別與12h、24h、48h、72h、7d斷頸處死。

1.3取材

三組均與造模后12h、24h、48h、72h、7d各處死9只大鼠，心臟灌注后斷頭取全腦，并立即將腦組織保存于4%的多聚甲醛0.1mol/L PBS的(pH 7.4)溶液中，固定72h以上。之后把固定的鼠腦從視交叉后2～6mm處做腦組織的冠狀切面，取其腦組織脫水石蠟包埋。用石蠟切片機將蠟塊連續切片，片厚約3μm，每5張取一張片作免疫組織化學，取部分做HE染色。

1.4腦組織病理形態

HE染色法觀察新生大鼠各時間點腦組織形態變化。

1.5 RGMa免疫組化染色

各組各時間點的腦組織切片分別用兔抗RGMa抗體作為一抗，二抗為生物素化山羊抗兔IgG，以PBS代替一抗作為對照。RGMa陽性為胞質染成淺黃色、棕黃色或者棕褐色.采用陽性細胞計數法，每張切片分別隨機選取海馬及皮質6個不重疊視野(×400)，在同一光強度下，計數RGMa陽性細胞數，計算陽性細胞數百分比，取平均值。

1.6統計學方法

采用SPSS.17.0軟件進行統計學分析。對各組的數據給予正態性檢驗和方差齊性檢驗比較各組數據均數，進行單因素方差，用均數±標準差表示，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1肉眼觀察大鼠腦組織形態

sham組大鼠腦組織形態正常，HIBD組隨造模時間延長，可見左側大腦出現水腫、壞死病灶，結扎側的腦半球形態發生改變。而奧拉西坦治療組腦組織水腫程度較HIBD組輕，未見液化壞死灶。

2.2腦組織病理變化

sham組腦組織各部位形態結構清晰，細胞層次清楚，形態正常。HIBD組隨著造模時間延長，依次出現細胞腫脹、神經元排列紊亂、細胞核固縮、碎裂及壞死灶周圍炎性細胞增多。奧拉西坦治療組各時間點細胞腫脹及核固縮、碎裂溶解的細胞數均少于HIBD組。

2.3 RGMa表達

在sham組可見少量RGMa陽性細胞; HIBD組RGMa陽性細胞數于造模12h后可見棕黃色陽性表達，24h表達升高，至48h達高峰，之后維持高濃度，較前逐漸下降。奧拉西坦治療組RGMa陽性細胞表達部位及變化規律與HIBD組相似，陽性細胞數在各時間點的表達均低于HIBD組，與HIBD組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，與sham組比較，HIBD組和奧拉西坦治療組陽性細胞數均多于sham組，差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表1，圖1。

表1　各組不同時間點RGMa陽性細胞數(%)比較(±s，n =9)

表1　各組不同時間點RGMa陽性細胞數(%)比較(±s，n =9)

注:與sham組比較，aP＜0.05，b與HIBD組比較P＜0.05。

組別12h　24h　48h　72h　7d sham組　6.00±2.57　6.17±2.38　6.73±2.88　6.59±2.41　6.96±2.43 HIBD組　26.47±2.90a　32.28±5.91a　58.59±6.51a　51.30±5.94a　40.40±5.45a奧拉西坦組　22.28±3.00ab　27.74±5.63ab　52.42±6.40ab　40.76±5.80ab　28.44±3.32abF值　265.67　145.49　473.14　394.34　332.48 P ＜0.05　　＜0.05　　＜0.05　　＜0.05　　＜0.05

圖1　sham組、HIBD組、奧拉西坦治療組大鼠大腦皮質不同時間點RGMa表達(免疫組織化學染色×200)

3　討論

HIBD是由多種原因引起的腦缺氧和(或)腦缺血性損傷，可引起新生兒圍生期腦損傷和長期神經系統的嚴重后遺癥，其后遺癥的發生與神經再生障礙關系密切。CNS損傷后神經再生修復能力，不僅與神經元自身的再生能力有關，還受神經元所處的生存環境中的各種外源性的生長促進因子和抑制性因子的共同影響。近年來研究比較多的RGMa蛋白，是一種排斥性軸突導向分子，可存在于脈絡叢、成熟髓磷脂和正形成的瘢痕等干擾軸突生長的結構中，通過與其受體Neogenin結合，激活RhoA－Rho激酶信號轉導途徑，使神經元軸索內細胞骨架重排、生長錐塌陷，并最終導致神經元凋亡、再生“流產”［1］。在本研究中，我們以新生7d齡Wistar大鼠為對象建立HIBD模型，觀察當發生缺氧缺血性腦損傷時RGMa的表達變化來評估軸突損傷及再生情況。在sham組，在新生大鼠的海馬區、大腦皮層的神經元及膠質細胞可見RGMa陽性細胞表達，表明RGMa存在于正常的腦組織中，并且可能參與了中樞神經系統的發育和生長調控。HIBD組，12h可見RGMa陽性細胞表達，24h升高，于48h達高峰，之后維持高濃度，并較前逐漸降低。由此推測RGMa在腦損傷急性期表達增加，抑制軸突再生，并且當RGMa達峰值時，其對軸突再生的抑制最大，隨著RGMa的降低，其對軸突的抑制作用逐漸降低。奧拉西坦可以選擇性的作用于大腦皮層和海馬，能夠改善腦水腫，保護受損細胞，激活和促進神經細胞功能的恢復，是一種新的中樞神經系統益智藥。張洋［2］等通過實驗證明奧拉西坦可以改善新生大鼠HIBD模型腦水腫。多項臨床實踐［3～5］證明奧拉西坦在治療腦卒中，老年癡呆，腦梗死等取得了很好的治療效果。有研究［6］將奧拉西坦應用于新生兒缺氧缺血性腦病，取得了良好的治療效果。國外學者［7］通過研究表明，在大鼠脊髓損傷模型中，使用RGMa特異性抗體后，結果表明RGMa抗體能夠綜合RGM，促進軸突生長。Feng J等［8］通過實驗證實，在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型中RGMa蛋白在缺血側皮質及海馬升高，通過給予RGMa特異性RNAi后可顯著促進軸突再生，改善大鼠的神經功能。近年來多項研究［9～12］表明，通過給予藥物干預，可促使RGMa表達下調，從而促進神經再生。本實驗結果表明奧拉西坦治療組無論在肉眼觀察大鼠的腦體形態，還是HE染色結果均顯示，應用奧拉西坦后腦組織的損傷程度均低于HIBD組;免疫組化結果顯示奧拉西坦組RGMa陽性細胞數在各個時間點均低于HIBD組，提示給予奧拉西坦后可能抑制RGMa的表達。目前未見有關奧拉西坦在HIBD中對RGMa的影響的報道。綜上所述，在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的試驗中，奧拉西坦可能通過下調RGMa的表達，促進軸突再生和修復。但是奧拉西坦下調RGMa的機制目前尚不清楚，這需要我們今后進一步探索。

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(收稿日期:2015－12－18)

通訊作者:王顯鶴(1966～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫師，副教授，碩士研究生導師。E－mail: 312037443@ qq.com。

作者簡介:丁蘭蘭(1990～)女，山東濟寧人，在讀碩士研究生。

基金項目:①1.佳木斯大學研究生科技創新項目，編號: LM2015_024 ; 2.佳木斯大學科學技術校級面上項目，編號: S2014－008。

中圖分類號:R743

文獻標識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－0018－03