CHD5及K－ras蛋白在大腸癌組織中的表達①

周　昱，廉奇鑫，王　新

(佳木斯大學附屬第一醫院腫瘤科，黑龍江佳木斯154003)

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CHD5及K－ras蛋白在大腸癌組織中的表達①

周昱，廉奇鑫，王新

(佳木斯大學附屬第一醫院腫瘤科，黑龍江佳木斯154003)

摘要:目的:通過研究CHD5和K－ras在結直腸癌組織中的各自臨床病理學指標的檢測、分析各自不同表達程度探索性討論二者是否具有相關性。方法:采用免疫組探索CHD5和K－ras在大腸癌組織中的表達。結果:①所選結直腸癌組織及其相應的癌旁正常組織中，CHD5表達陽性率分別為32.50% (13/40)與72.50% (29/40)，所以在結直腸癌旁正常組織中CHD5蛋白多為明顯陽性表達。經統計學系統運算明確發現: CHD5蛋白的表達與所選患者組織分化程度、腫瘤臨床Dukes分期、淋巴結轉移情況以及預后好壞程度有關(均P＜0.05)，與直腸腫瘤浸潤的深度、患者的年齡、性別、腫瘤大小范圍無關(P＞0.05)。②所選結直腸癌組織及其相應的癌旁正常組織中，K－ras蛋白表達的陽性率分別為67.5% (27/40)與37.50% (15/40)，并且所選結直腸癌組織中K－ras蛋白多為陽性表達。經系統的統計學分析發現，K－ras蛋白的表達與患者腫瘤的組織分化程度、腫瘤臨床Dukes分期、淋巴結轉移情況以及預后的好壞程度關系非常密切(P＜0.05)，相反與、結直腸腫瘤浸潤深度、腫瘤大小范圍及結直腸癌患者年齡、性別無相關性(P＞0.05)。結論:①在結直腸癌組織中CHD5表達下降與浸潤深度、組織分化程度、患者是否出現淋巴結轉移以及TNM分期有關，②K－ras在胃正常組織中表達不明顯，在胃癌中高表達。且與浸潤深度、組織分化程度、是否出現淋巴結轉移以及TNM分期密切相關。③CHD5與K－ras表達具有負相關性，提示二者有彼此制約、相互拮抗的作用。

關鍵詞:結直腸癌; CHD5; K－ras

結直腸癌是人類最常見的腸道系統惡性腫瘤之一［1］，位居第三位并且逐年顯著增加的也是本課題所深入研究組織標本—結直腸癌(colorectal cancer，CRC)，因結直腸癌導致死亡占據全部癌癥致死比例大約有10%［2］，其發病比例更是長期占據發展中國家成人非良性腫瘤發生比例的第五席位。結直腸癌作為成年人消化道常見的惡性腫瘤，令臨床工作者感到困惑的便是其居高不下的發病率和死亡率，在這方面略低于胃癌及食道癌［3］，本實驗研究在結腸癌中CHD5和K－ra是否有的表達及兩者之間有無意義，為結腸癌早期診斷及預后提供科學依據。

1　資料與方法

1.1標本來源

選取2012－09～2015－07佳木斯大學附屬第一醫院病理科取外科部分第一次結直腸癌手術切除后，均能保證術后病理學診斷明確、術中切除組織邊緣證實陰性、臨床資料信息完整。本實驗反復對比選擇并且都經臨床病理準確診斷的40例標本蠟塊，術后均由經驗豐富的病理科醫師進行病理學確認，患者實施手術前都未曾進行腫瘤放射治療、抗腫瘤化學藥物應用及全身抗癌生物學免疫治療。所選結直腸癌標本中男21例，女19例，標本年齡39～74 歲(中位年齡51歲)。采用2010年國際抗癌聯盟/美國癌癥聯合委員會Dukes分期標準各期所占比例為: A + B期24(60%)，C + D期16(40%)，結合術后病理資料學及多項影像檢查能夠充分證實高、中分化22例(55%)，低分化18例(45%)存在淋巴結轉移20例(50%)，不存在淋巴結轉移20例(50%)。詳細采集病史、家族史、腸鏡檢查報告、系統查體情況、腫瘤標志物系列檢查結果，資料比較差異均無統計學意義(P＜0.05)。

1.2主要試劑

鼠抗CHD5(染色質解旋酶DNA結合蛋白5)抗體購自上海聯碩生物科技有限公司，鼠抗K－ras(突變型)抗體購自北京博奧森生物科技有限公司。

1.3免疫組化

通過免疫組化方法(Elivision法)探索CHD5和K－ra在為癌及正常癌旁組織中的表達情況。

1.4結果判定

采用經典雙盲法對實驗結果進行認真的觀察比較和仔細記錄。陽性的細胞的判定標準為細胞中有棕黃色顆粒，CHD5蛋白陽性反應為棕黃色顆粒在腫瘤細胞的細胞核及細胞質中均有分布，但其在結直腸癌組織中核表達明顯強于胞質表達，而K－ras蛋白主要分布于腫瘤細胞的細胞質中。根據在同類細胞中陽性細胞數所占的比例進行劃分、登記，并采用半定量積分的方式對免疫組織化學染色的結果進行分級，即根據細胞染色強度(A)和染色細胞所占的比例(B)積分之積(A + B)來判定。染色強度A分為4級:無特意染色為0分、輕度染色(淡黃色) 為1分、中度染色(棕黃色)為2分、強染色(深棕黃色)為3分;根據在同類細胞中，棕色細胞數所占的百分比，將B(染色細胞所占的比例)分為5級:＜5%的為0分、5%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、＞75%的則為4分。判斷表達結果的標準時陽性細胞百分比得分與強度得分之和，不同的積分代表不同的陽性強度，總積分在0～1分之間則表示陰性(－)、總積分之在2～7分則表示陽性，也就是說A + B≤1是陰性，A + B＞1是陽性。陽性強度分級則以不同積分標準校對即2～3分為弱陽性(+ )、4～7分為強陽性(+ + )［4］。CHD5以細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性。在400倍視野下觀察腫瘤細胞，每個視野觀察100個腫瘤細胞，隨機計算5個視野，以細胞不著色或小于5%的細胞著色為陰性，多大于5%的腫瘤細胞著色為陽性。

1.5統計學方法

采用SPSS17.0軟件進行統計學處理，同樣采用經典的計數資料χ2檢驗進行分析，運用Spearman等級相關分析在結直腸癌及同一標本癌旁正常組織中兩種CHD5及K－ras蛋白表達之間的相關性P＜0.05表示具有統計學差異。

2　結果

2.1 IHC法檢測CHD5在結直腸癌組織與癌旁正

常組織的表達

通過IHC法檢測，所采集40例結直腸癌組織中，CHD5的陽性表達率為32.50% (13/40)，低于同一標本的癌旁正常組織的72.50% (29/40)，二者差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.2 IHC法檢測K－ras蛋白在結直腸癌組織與癌

旁正常組織的表達

本通過IHC法檢測，在所有40例結直腸癌組織中，K－ras的陽性表達率為67.5% (27/40)，高于同一標本的癌旁正常組織的37.50% (15/40)，二者差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表1　CHD5蛋白在結直腸癌組織癌以及旁正常組織細胞中的表達

表2　K－ras在正常組織和腫瘤組織中的表達

2.3結直腸癌組織中CHD5與K－ras蛋白的表達

與臨床病理參數之間的關系

結合結直腸癌標本中CHD5蛋白的免疫組織化學實驗結果和病例的臨床病理資料，分析顯示:結直腸癌組織中CHD5蛋白表達程度與結直腸癌腫瘤學行為病理學表象、臨床Dukes分期的情況、腫瘤不同分化程度的高低以及是否存在淋巴結轉移的均存在相關性。見表3。

表3　結直腸癌組織CHD5蛋白的表達與臨床病理參數之間的關系［例(%)］

表4　結直腸癌中CHD5與K－ras蛋白的關系

2.4結直腸癌組織中CHD5與K－ras表達水平的相關性

本實驗研究中，免疫組織化學結果顯示: 40例結直腸癌患者中，腸癌組織胞核CHD5與K－ras均陽性表達者僅4例，胞核CHD5與K－ras蛋白均陰性表達者4例。運用Spearman等級相關分析進行研究分析，結果顯示:等級相關系數r =－0.527，具有統計學意義(P＜0.01)，提示結直腸癌中胞核CHD5與K－ras蛋白表達呈負相關。見表4。

3　討論

CHD5作為染色質解旋酶DNA結合蛋白家族最新一員，經由p19Arf/p53路徑來完成調控細胞增殖、衰亡等一系列演變，并且仍能通過自身的雜合缺失來識別并調控很多靶基因，誘導靶基因從而抑制其降解，參與靶基因調控，調節腫瘤細胞不斷生長、增殖、分化、信號的轉導、轉錄及翻譯、血管的新生、蛋白質轉運、細胞的凋亡以及其新陳代謝等多種生理生化過程。K－ras蛋白則是一種比較常見和熟悉原癌基因，其所調控腫瘤學行為的通路開關功能更是很早就被人們所熟知并應用于臨床，屬于ras基因家族的成員［5］。K－ras蛋白的突變能誘導多種靶基因發生變化，并相互作用，導致多種靶基因的增殖顯著［6］。惡性腫瘤通常都具有慢性炎癥性疾病的特點，CHD5及K－ras蛋白均不同程度通過調節介導炎性細胞因子的增殖，促進相關炎癥基因的表達，從而在腫瘤形成極初期中起到一定的推動作用［6，7］。進一步我們可以大膽推斷: CHD5及K－ras蛋白共同成為常規結直腸腫瘤標志物服務于早期腫瘤學行為的精準檢測項目指日可待。綜上所述，本實驗經Spearman等級相關分析，具有統計學意義(r =－0.527，P＜0.01，)提示結直腸癌腫瘤學行為發生、發展的過程中CHD5及K－ras蛋白表達呈負相關。在不久的將來極有可能通過聯合檢測對比CHD5和K－ras蛋白在結直腸組織中的表達情況，如發現CHD5蛋白表達陰性的同時K－ras在結直腸組織中表達陽性，可以為臨床提供該檢測結直腸組織有可能癌變的金標準。所以我們可以大膽的設想:未來臨床檢測CHD5和K－ras在結直腸腸組織中的表達水平，對評價結直腸癌惡腫瘤學行為早期發現、監控結直腸癌患者疾病進展、判定惡性程度和預測預后至關重要。

參考文獻:

［1］陳福軍，于海濤，趙斌，等.CD44V6和RAB5a在結腸癌中的表達及相關性研究［J］.黑龍江醫藥科學，2012，35(3) : 7－8

［2］Markku HR，Hirvikoski VP，Ristim ki A，et al.CHD5 expression is a marker of poor prognosis in renal cell carcinoma［J］.Tumor Biol，2011，32: 481－487

［3］Claret FX，Hibi M，Dhut S，et al.A new group of conserved coactivators that increase the specificity of AP－1 transcription factors［J］.Nature，1996，383(6599) : 453－457

［4］任占平，黃鍵輝，石喆，等.免疫組織化學反應結果判斷標準［J］.中國腫瘤學雜志，2009，6(4) : 229－231

［5］李晟，蔡琳，劉啟玲，等.結直腸癌中k－ras基因突變與Fascin1蛋白表達的相關性［J］.臨床與實驗病理學雜志，2015，31(8) : 869－872

［6］Ikeguchi M，Sakatani T，Endo K，et al.Computerized nuclear morphometry is a useful technique for evaluating the high metastic potiential of colorectal adenocarcinoma［J］.Cancer，1999，86(10) : 1944－1951

［7］Barbacid M，Saito H，Clement JM.Ras genes［J］.Ann Rev Biochem，2003，5(6) : 779－827

(收稿日期:2015－12－07)

通訊作者:王新(1962～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫師，碩士研究生導師。E－mail: zhouyu731@126.com。

作者簡介:周昱(1969～)男，黑龍江集賢人，學士，副主任醫師，碩士研究生導師。

基金項目:①1.黑龍江省青年基金項目，編號: QC2013C013; 2.佳木斯大學青年基金項目，編號: sq2013－013。

中圖分類號:R735.3+4

文獻標識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－0039－03