HtrA1絲氨酸蛋白酶在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)①

張立娜，呂敬媛，宋寶杰，邢天容，陳　麗

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江佳木斯154003)

?

HtrA1絲氨酸蛋白酶在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)①

張立娜，呂敬媛，宋寶杰，邢天容，陳麗

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江佳木斯154003)

摘要:目的:觀察絲氨酸蛋白酶HtrA1在子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMT)中在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜以及正常子宮內(nèi)膜和血清中的表達(dá)情況，探討HtrA1在子宮內(nèi)膜異位中的作用以及臨床意義。方法:通過S－P免疫組織化學(xué)方法檢測HtrA1在50例EMT患者在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織的表達(dá)，并與50例正常內(nèi)膜進(jìn)行比較;應(yīng)用ELISA法檢測以上所有患者血清中HtrA1的濃度。結(jié)果: HtrA1在EMT患者異位及在位內(nèi)膜的表達(dá)顯著低于對照組(P＜0.05) ;在異位內(nèi)膜的表達(dá)顯著低于在位的內(nèi)膜組(P＜0.05) ;在EMT患者外周血清中濃度顯著低于對照組(P＜0.05) ;術(shù)前外周血中HtrA1的水平均顯著低于術(shù)后第7天(P＜0.05)。結(jié)論: HtrA1可能在EMT的發(fā)病過程中起到一定作用，并且HtrA1可以作為EMT臨床診斷及預(yù)后隨訪的血清標(biāo)記物。

關(guān)鍵詞:絲氨酸蛋白酶A1;免疫組織化學(xué);酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn);子宮內(nèi)膜異位癥

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMT)是指包括腺體和間質(zhì)在內(nèi)的正常活性的子宮內(nèi)膜組織，通過各種方式轉(zhuǎn)移到子宮腔或子宮體肌層之外的其它部位［1］。既往研究表明，異位子宮內(nèi)膜組織的存活、增殖與腫瘤組織的浸潤、增殖、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等惡性行為相似［2］。HtrA1(high－temperature requirement factor A1)是具有腫瘤抑制效應(yīng)的絲氨酸蛋白酶家族成員之一，具有腫瘤抑制效應(yīng)，在原發(fā)性肝癌及宮頸癌、卵巢癌中均呈低度表達(dá)［3～5］，并且在子宮內(nèi)膜癌中也得到證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)通過研究EMT患者HtrA1分別在組織和血清中的表達(dá)，探討此因子在EMT進(jìn)展過程中的意義，對進(jìn)一步闡明EMT病理生理機(jī)制大有裨益。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2014－09～2015－06在佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科收治的術(shù)后的病理回報(bào)為子宮內(nèi)膜異位囊腫的病患50例作為實(shí)驗(yàn)組，取異位和在位內(nèi)膜組織，分為異位內(nèi)膜組和在位內(nèi)膜組。另選同時(shí)期因子宮疾病(排除子宮內(nèi)膜異位癥)，行手術(shù)治療的患者50例作為對照組，取其正常子宮的內(nèi)膜為對照組。入選患者年齡34～47歲，平均(38.2±9.1)歲，平均初潮年齡(14.7±2.5)歲，所有患者月經(jīng)規(guī)律者，采集標(biāo)本之日前6個(gè)月內(nèi)，未接受過任何激素治療者，近6個(gè)月內(nèi)未有妊娠、哺乳等，近6個(gè)月內(nèi)未接受過放療、化療、生物治療者，近1年內(nèi)未使用過宮內(nèi)節(jié)育器者，病理專家復(fù)核確診病理切片。

1.2標(biāo)本處理

①內(nèi)膜組織:將處理干凈的病理組織置40g/L甲醛液中固定24h，制成蠟塊，4℃保留;②血清:分別抽取所有研究對象手術(shù)當(dāng)天及術(shù)后第7天晨起空腹時(shí)外周靜脈血2mL至促凝管內(nèi)，置水浴箱靜止

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，對計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)均已均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)的形式表示，P＜0.05有顯著差異。

2　結(jié)果

2.1 HtrA1在內(nèi)膜組織中的表達(dá)

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示EMT組HtrA1在異位及在位內(nèi)膜的陽性表達(dá)率顯著低于對照組(P＜0.05) ;且在位的內(nèi)膜組的陽性表達(dá)率顯著高于異位的內(nèi)膜組(P＜0.05)。見表1，圖1。 10min，水浴箱的溫度為37℃，然后離心8min(速度: 4000r/min)，取上清液體置于干燥的無菌管內(nèi)，置－80℃環(huán)境中冷藏保存?zhèn)錅y。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

采用SP法檢測HtrA1在各種內(nèi)膜組織中表達(dá);外周血清中HtrA1濃度采用ELISA法進(jìn)行檢測。HtrA1抗體及血清試劑盒均來自于哈爾濱市南崗區(qū)賽特生物技術(shù)工作室。按試劑的說明進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)操作。

1.4結(jié)果判定

每個(gè)標(biāo)本做切片3張，每張切片在×400倍鏡下取4個(gè)互不重疊的視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，共400個(gè)細(xì)胞，并數(shù)出染色細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算該切片(即該標(biāo)本)的染色細(xì)胞所占比例=染色細(xì)胞總數(shù)/400× 100%。HtrA1染色結(jié)果判定: HtrA1主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，為棕黃色或黃褐色顆粒。陰性－) :染色細(xì)胞比例≤5%;弱陽性(+ ) :染色細(xì)胞比例在6%～25%;中等陽性() :染色細(xì)胞比例在26%～50%;強(qiáng)陽性() :染色細(xì)胞比例＞50%。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

圖1 A正常子宮內(nèi)膜B在位內(nèi)膜C異位內(nèi)膜(免疫組化染色，×400)

表1　HtrA1在異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、對照組的表達(dá)(n =50)

2.2血清中HtrA1的表達(dá)

HtrA1在EMT組術(shù)前血清中濃度顯著低于對照組(P＜0.05)。術(shù)前外周血中HtrA1的水平均顯著低于術(shù)后第7天(P＜0.05)。見表2。

表2　血清中HtrA1的表達(dá)(±s，n =50，pg/mL)

表2　血清中HtrA1的表達(dá)(±s，n =50，pg/mL)

注:*與對照組相比，P＜0.05;#與術(shù)后7d相比，P＜0.05。

組別　　術(shù)前　　術(shù)后7d EMT組　121.92±56.78* #　196.78±74.26*對照組392.59±56.17　390.47±83.41

3　討論

HtrA家族廣泛存在于微生物及動(dòng)植物組織中，目前發(fā)現(xiàn)在多種病理生理過程中均有該家族成員參與，如細(xì)胞凋亡、生長、衰老及應(yīng)激反應(yīng)、癌癥、關(guān)節(jié)炎等［4］。HtrA1是近年來新發(fā)現(xiàn)的絲氨酸蛋白酶家族成員之一，該因子在原發(fā)性肝癌、卵巢癌、宮頸癌及子宮內(nèi)膜癌中均呈低度表達(dá)，并隨腫瘤惡性程度的升高，其下調(diào)性表達(dá)越明顯，表明HtrA1具有腫瘤抑制效應(yīng)［3～6］。EMT雖為良性病變，但是生物學(xué)行為卻具有惡性腫瘤的特征(侵襲性、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等)，本研究結(jié)果顯示HtrA1在EMT患者異位的內(nèi)膜表達(dá)低于對照組，表明HtrA1可能參與盆腔內(nèi)其他部位EMT的進(jìn)展過程。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HtrA1在EMT患者在位的內(nèi)膜中表達(dá)明顯低于對照組別，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有意義，提示從生物學(xué)行為的角度，在位的內(nèi)膜與正常子宮的內(nèi)膜具有差別，在位的內(nèi)膜的生物學(xué)行為可能是EMT發(fā)生過程中一個(gè)比較重要的因素，從而驗(yàn)證了“在位內(nèi)膜決定論”。卵泡抑素(follistatin FS) 和HtrA1的N末端區(qū)域具有高度相似性，F(xiàn)S是TGF －β的拮抗劑，因此提出HtrA1是一種新型的TGF －β拮抗劑［7］。諸多研究提示TGF－β在EMT異位病灶中表達(dá)顯著升高，HtrA1可拮抗TGF－β信號(hào)通路的活化，抑制細(xì)胞增殖，表現(xiàn)為腫瘤抑制效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HtrA1在異位、在位內(nèi)膜及對照組中的表達(dá)呈上升趨勢，異位病灶的形成涉及了細(xì)胞增殖過程，因此表現(xiàn)為增殖抑制效應(yīng)的HtrA1的表達(dá)受到抑制甚至無表達(dá)，削弱對TGF－β及TGF－β介導(dǎo)的信號(hào)通路效應(yīng)，導(dǎo)致TGF－β內(nèi)腹腔內(nèi)異位病灶處高表達(dá)，促進(jìn)異位的內(nèi)膜的增殖以及存活，EMT進(jìn)展過程起到重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)還檢測了所有患者血清中HtrA1的濃度，結(jié)果示EMT組低于對照組，EMT組術(shù)前血清中HtrA1的濃度低于術(shù)后第7天，表明其可能具備血清標(biāo)志物的特性，可能具有一定的臨床價(jià)值，或許可為EMT的術(shù)前診斷及預(yù)后隨訪提供新思路。但本次實(shí)驗(yàn)研究樣本量較少，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)存在一定誤差和局限性，需待更多嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計(jì)，大量的樣本，多中心進(jìn)行的臨床研究進(jìn)一步明確其相關(guān)臨床意義。

綜上所述，HtrA1在EMT患者異位和在位的內(nèi)膜及血清中表達(dá)低于對照組，但是術(shù)后第七天EMT患者薛強(qiáng)中的表達(dá)高于術(shù)前，表明從組織學(xué)及血清學(xué)角度進(jìn)行分析，HtrA1可以作為EMT診斷及預(yù)后隨訪的血清標(biāo)記物，同時(shí)HtrA1可能在EMT進(jìn)展過程中起到一定的作用。

致謝:感謝佳木斯大學(xué)科技創(chuàng)新項(xiàng)目對我的資助，感謝佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心的老師們對我的幫助。

參考文獻(xiàn):

［1］胡玉紅，石瑾，張燕.子宮內(nèi)膜異位癥患者survivin蛋白的表達(dá)及臨床意義［J］.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2010，33(2) : 39－40

［2］劉德財(cái)，盧北燕，羅佳濱.子宮內(nèi)膜異位癥的免疫病因?qū)W研究進(jìn)展［A］.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2009，32(4) : 87－89

［3］金雷，朱峰，秦錫虎.HtrA1絲氨酸蛋白酶在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及其臨床意義［J］.中國普通外科雜志，2011，20(1) : 43－47

［4］Park S－S，Park S－K，Lim J－H，et al.Expression of human HtrA1，HtrA2，HtrA1 and TGF－β1 genes in primary endometrial cancer［J］.Oncol Rep，2009，21(1) : 1529－1537

［5］Singh H，Li Y，F(xiàn)uller PJ，et al.HtrA1 is downregulated in cancer cell lines and significantly reduced in primary serous and granulosa cell ovarian tumors［J］.J Cancer，2013，4(2) : 152－164

［6］Bowden M a，Drummond AE，F(xiàn)uller PJ，et al.High－temperature requirement factor A3 (HtrA1) : A novel serine protease and its potential role in ovarian function and ovarian cancers［J］.Mol Cell Endocrinol，2010，327(1－2) : 13－18

［7］Park S－S，Park S－K，Lim J－H，et al.Expression of human HtrA1，HtrA2，HtrA3 and TGF－β1 genes in primary endometrial cancer［J］.Oncol Rep，2009，21(1) : 1529－1537

(收稿日期:2015－12－03)

通訊作者:呂敬媛(1978～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E－mail: 503253411@ qq.com。

作者簡介:張立娜(1986～)女，黑龍江黑河人，在讀碩士研究生。

基金項(xiàng)目:①佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào): LZR2014_015。

中圖分類號(hào):R711.71

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1008－0104(2016) 02－0042－02