口腔鱗癌組織中TLR4及NF－κB p65的表達和意義①

楊　鍵，張國梁，關　鍵

(1.佳木斯大學研究生學院，黑龍江佳木斯154007;2.佳木斯大學附屬第二醫院，黑龍江佳木斯154002)

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口腔鱗癌組織中TLR4及NF－κB p65的表達和意義①

楊鍵1，張國梁2，關鍵2

(1.佳木斯大學研究生學院，黑龍江佳木斯154007;2.佳木斯大學附屬第二醫院，黑龍江佳木斯154002)

摘要:目的:討論在口腔鱗癌(Oral squamous cell carcinomas，OSCC)發生發展過程中Toll樣受體4 (toll like receptor 4，TLR4)、核因子－κB p65(NF－κB p65)存在的作用。方法:采用免疫組化SABC法分別檢測TLR4、NF－κB p65在11例癌旁正常組織和37例OSCC組織中的表達情況，討論兩者表達的相關性以及與OSCC中不同臨床病理因素之間的關系。結果: TLR4、NF－κB p65的陽性率在OSCC組織中較癌旁正常組織高(P均＜0.05) ; TLR4、NF－κB p65的陽性率與OSCC組織的局部侵襲性、分化程度相關(P均＜0.05)，NF－κB p65的陽性率還與淋巴結轉移相關(P = 0.023) ; TLR4、NF－κB p65在OSCC組織中的陽性率呈正相關(r = 0.618，P = 0.000)。結論: TLR4、NF－κB p65對OSCC的發生發展有重要意義。

關鍵詞:口腔鱗癌;核因子－κB p65; Toll樣受體4;免疫組化

口腔鱗癌(Oral squamous cell carcinomas，OSCC)多發于鱗狀上皮覆蓋的部位，它的發病機制至今還未完全闡明。90%左右的口腔頜面部惡性腫瘤為OSCC，并且近年來呈現逐漸上升且年輕化的趨勢［1］。它的致病因素復雜，不僅與外在因素如煙酒、物理、化學刺激相關，也與內在因素如精神、免疫、遺傳相關。近年來隨著相關學科的進步，對OSCC的研究也不斷深入，通過研究相關基因、受體等腫瘤標志物在OSCC組織中的表達情況以便對其發生和發展的過程作進一步深入了解已經成為研究的熱點問題［2］。本實驗通過SABC法分別檢測Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)、核因子－κB p65 (NF－κB p65)在OSCC、癌旁正常組織中的表達情況，剖析闡述兩者在OSCC、癌旁正常組織中不同表達特征間的聯系以及與OSCC臨床病理因素之間存在的關系，旨在討論OSCC發生和發展過程中TLR4、NF－κB p65可能存在的作用。

1　材料和方法

1.1材料

采集佳木斯大學附屬口腔醫院2013～2015年初經本院口腔頜面外科手術治療并經病理診斷為OSCC的成年患者共計37例，上述患者臨床病理學資料詳實，術前3個月內均未接受放化療，其中男30例，女7例;年齡41～88歲，平均63.8歲;淋巴結轉移9例，未見淋巴結轉移28例;有局部侵襲性33例，無局部侵襲性4例;按照2005年WHO制定的標準分為高分化10例、中分化23例、低分化4例。另取11例癌旁正常組織，并經HE染色，鏡下觀察證明無任何黏膜疾病。以上標本均經10%福爾馬林固定，常規石蠟包埋后按每張4μm的厚度作連續切片。

1.2試劑

一抗兔抗人TLR4(1: 150)、NF－κB p65(1: 150)親和純化抗體，SABC檢測試劑盒，DAB試劑盒均購于武漢博士德生物有限公司。

1.3方法與判定標準

采用免疫組化SABC法，嚴格按照說明書要求操作。出現黃或黃褐色為陽性著色，TLR4的表達產物位于細胞質、細胞膜中，NF－κB p65的表達產物位于細胞質、細胞核中。實驗結果根據切片的著色強度以及陽性OSCC細胞數在OSCC細胞總數中的占比這兩方面進行綜合分析判斷，判定OSCC細胞的著色強度:無著色(－)，淡黃色(+ )，黃色(+ + )，黃褐色(+ + + ) ;判定陽性OSCC細胞占比:隨機在切片中選擇5個400倍的高倍細胞視野，陽性細胞占比≤10% (－)，11%～25% (+ )，26%～49%(+ + )，≥50% (+ + + ) ; (－)、(+ )、(+ + )、(+ + + )分別代表0分、1分、2分、3分。每張切片按著色強度與陽性OSCC細胞在OSCC細胞中的占比相加得出。陰性(＜2分)，陽性(≥2分)。每批次實驗均設置空白對照(PBS代替一抗)、陽性對照(已知陽性切片)。

1.4統計學方法

采用SPSS21.0軟件，采用Fisher確切概率法進行組間數據比較;使用Spearman秩相關檢驗分析指標間的關系;使用Kruskal－Wallis H檢驗分析病理等級資料。均以α=0.05為檢驗標準。

2　結果

2.1 TLR4、NF－κB p65在OSCC、癌旁正常組織中的表達

在OSCC組織中TLR4、NF－κB p65的陽性率分別為56.8%、54.1%，在癌旁正常組織中的陽性率分別為18.2%、9.0%，組間差異有統計學意義(P均＜0.05，見表1) ; TLR4、NF－κB p65在OSCC組織中的陽性表達(見圖1～2)。

免疫組化SABC法檢測OSCC組織中TLR4、NF－κB p65的表達(箭頭所指處為腫瘤細胞)。

圖1　TLR4(×400)

圖2　NF－κB p65(×400)

2.2 TLR4、NF－κB p65在OSCC組織中的表達與

病理因素之間的關聯

TLR4、NF－κB p65在OSCC組織中的陽性率與性別、年齡無關(P均＞0.05)，與分化程度、局部侵襲性有關(P均＜0.05) ; NF－κB p65的陽性率還與淋巴結轉移有關(P＜0.05)。見表1。

表1　TLR4和NF－κB p65在癌旁正常組織中的表達及在OSCC組織中的表達與臨床病理因素之間的關系

2.3 TLR4、NF－κB p65在OSCC組織中表達關系

在21例TLR4呈陽性表達的OSCC組織中，有20例NF－κB p65也呈陽性表達，兩者在OSCC組織中的表達呈正相關(r = 0.618，P＜0.01)，見表2。

表2　TLR4、NF－κB p65在OSCC組織中的表達關系

3　討論

口腔鱗癌是多種復雜因素共同作用導致的疾病，要改善患者的預后，關鍵就需要做到盡早診斷盡早治療。近年來發現腫瘤的產生和發展與TLR4、NF－κB p65的過度活化密切相關［3，4］。研究表明，TLRs通過激活NF－kB所構建的腫瘤微環境在促進惡性腫瘤的發生和發展中有重要的作用。目前TLRs和NF－kB作為多種疾病的治療靶點已經成為研究的熱點。

TLRs屬于I型跨膜蛋白，為單個的跨膜非催化性蛋白質，分為胞外結構域(識別受體，介導形成胞外受體復合物)，跨膜結構域以及胞內信號區(激活下游信號傳導區域)，根據TLRs識別病原相關分子模式的不同可將其分為不同種類，目前為止發現的TLRs至少已經有11種。其中TLR4是最早被發現的一種廣泛存在于多種正常細胞和腫瘤細胞中參與天然免疫的病原相關分子模式識別受體，在天然免疫和獲得性免疫間起到橋梁作用，腫瘤細胞逃脫免疫監視及生長轉移與它的異常高表達密切相關。本研究表明TLR4在OSCC組中的陽性表達率(56.8%)較癌旁正常組(18.2%)高(P＜0.05) ;同時對不同分化程度的OSCC中TLR4的陽性率(分別為高分化20%、中分化69.6%、低分化75%)，進行H檢驗分析，表明隨著OSCC分化程度降低，TLR4的陽性率逐漸增高(P＜0.05) ;此外TLR4的過表達與OSCC是否存在局部侵襲性密切相關(P＜0.05)。而且TLR4在OSCC組織中的表達與年齡、性別(P均＞0.05)無關，這些都提示TLR4的異常高表達可能通過相應的信號傳遞從而誘發級聯反應，在OSCC的發生、發展、侵襲過程中起重要作用，這符合王［5］在子宮內膜癌中關于TLR4 和NF－κB p65的研究。

NF－κB是一種可以通過對靶基因的調節從而參與細胞增殖、分化、凋亡等活動的核轉錄因子。NF－κB家族包含五個多肽鏈亞基，在靜息狀態下它們互相之間以二聚體的形式結合，無活性的存在于細胞質中，根據組成二聚體的蛋白不同分為同源或異源兩種，其中主要是p65/p50異二聚體(p65是發揮轉錄激活功能的主要成分［6］)。當NF－κB通路受炎癥、細胞因子等刺激被激活后，使細胞質中與NF－κB結合的抑制因子IkB泛素化降解，并最終活化NF－κB從細胞質轉位進入細胞核，參與多種細胞的應激、增殖、凋亡、合成和分泌細胞因子等生理病理過程［7］。研究發現多種惡性腫瘤中都存在NF－κB的過度活化。本研究表明NF－κB p65在OSCC組中的陽性率(54.1%)較癌旁正常組(9.0%)高(P＜0.05)，同時對不同分化程度的OSCC中NF－κB p65的表達情況進行統計學分析后，發現其行為與TLR4類似，也是隨著OSCC組織的分化程度降低，NF－κB p65的陽性率增高(P＜0.05)，這符合有關學者［8］在胃癌中關于NF －κB p65的研究。此外NF－κB p65的陽性率在具有局部侵襲性的OSCC組織中異常增高(P＜0.05)，提示NF－κB p65的過表達在OSCC發生、發展、侵襲中可能發揮重要作用，亦提示NF－κB p65過度活化后在細胞惡變，癌細胞增殖、抗調亡過程可能起到促進作用。

同時，對TLR4、NF－κB p65在OSCC組織中的表達水平進行統計分析后，發現兩者呈正相關關系(r = 0.618，P＜0.01)，TLR4可能對NF－κBp65的生成起到正向調節作用，兩者在OSCC組織中的表達變化具有比較顯著的協同性。提示TLR4 /NF －κBp65通路的過表達對OSCC的發生發展可能起到促進作用，其可能原因是該通路參與影響了細胞間黏附蛋白、細胞內周期蛋白等關鍵蛋白的的合成，并且調控了抗凋亡基因的表達，從而使OSCC侵襲性變強，分化程度變差并且出現淋巴結的轉移。可以設想，對通路關鍵環節進行控制可能是用于治療OSCC的新思路。此外本次研究還發現在OSCC組織中NF－κB p65的陽性率與淋巴結轉移有關(P＜0.05)，提示NF－κB p65的過度活化可能參與了OSCC的淋巴結轉移過程，但是與NF－κB p65不同的是，TLR4在OSCC組織中的陽性率與淋巴結轉移因素無明顯相關性(P = 0.05)，這個結果可能與本次實驗收集的OSCC例數太少有關，也可能提示TLR4/NF－κB p65信號通路可能受多種因素調控影響。

綜上所述，通過聯合檢測分析TLR4、NF－κB p65在OSCC中的表達情況對于臨床上OSCC的診斷、惡性程度的評估有現實意義。下一步研究準備通過分別抑制OSCC細胞中TLR4、NF－κB p65的表達，檢測分析兩者對OSCC細胞增殖、凋亡等影響，以期為OSCC的預防和靶向治療提供新線索。

參考文獻:

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［7］Witzel I I，Koh L F，Perkins ND.Regulation of cyclin D1 gene expression.［J］.Biochemical Society Transactions，2010，38: 217－222

［8］陳軍，覃思繁，林思彤，等.胃癌組織中c—FLIP、NF—kBp65的表達變化及意義［J］.山東醫藥，2013，(3) : 22－24

(收稿日期:2015－07－30)

通訊作者:關鍵(1969～)男，黑龍江齊齊哈爾人，碩士，教授，主任醫師，碩士研究生導師。E－mail: guanjian1207@163.com。

作者簡介:楊鍵(1990～)男，浙江臨安人，在讀碩士研究生。

基金項目:①佳木斯大學研究生科技創新項目，編號: LM2014－040。

中圖分類號:R739.81

文獻標識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－0047－03