RT－PCR檢測SALL4基因骨髓增生異常綜合征的表達①

武廣海，田黎明，于廣晴，張　純，袁嘉怡，申福國

(1.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江佳木斯154003;2鶴崗市人民醫院急救中心，黑龍江鶴崗154100)

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RT－PCR檢測SALL4基因骨髓增生異常綜合征的表達①

武廣海1，2，田黎明1，于廣晴1，張純1，袁嘉怡1，申福國1

(1.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江佳木斯154003;2鶴崗市人民醫院急救中心，黑龍江鶴崗154100)

摘要:目的:探討骨髓增生異常綜合征(MDS)患者骨髓中SALL4mRNA表達及其臨床意義。方法:通過RT－PCR方法分別檢測13例難治性貧血患者(MDS－RA)、27例難治性貧血伴原始細胞增多患者(MDS－RAEB)和11例正常對照組骨髓單個核細胞(BMMNC)中SALL4mRNA表達情況，并比較MDS－RA和MDS－RAEB之間的表達差異。結果: MDS患者骨髓中SALL4 mRNA表達均明顯高于正常對照，且MDS－RAEB表達量高于MDS－RA，差異有統計學意義(P＜0.01)。結論: SALL4mRNA基因可能參與了MDS的發病，MDS－RA和MDS－RAEB之間的SALL4基因表達差異可能提示2者的發病機制的不同。

關鍵詞:SALL4mRNA;骨髓增生異常綜合征; RT－PCR

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)是一組髓系具有異質性呈病態克隆性疾病［1］，其基本病變主要是造血干克隆性增生、祖細胞異常發育，往往累計數個造血系統(例如粒系、紅系和巨核系等)為主要特點的血液系統疾病; MDS臨床特征主要表現為造血異常、血細胞的質與量出現異常，并有向急性白血病高危轉化的可能［2，3］。MDS目前扔沒有統一有效的治療方案，其臨床治療預后差，其疾病的病因和發病機制目前尚不明了。依據2008年最新WHO的分型修訂版中將MDS劃分為七型［4］:①難治性血細胞減少伴單系病態造血(RCUD )，②難治性貧血伴環狀鐵粒幼細胞(RARS )，③難治性血細胞減少伴多系病態造血(RCMD)，④難治性貧血伴原始細胞增多－1(RAEB －1)，⑤難治性貧血伴原始細胞增多－2(RAEB－2)，⑥MDS－未分類(MDS－U )，⑦MDS伴單純5q－。而在實際的臨床工作中既往FAB協作組分型仍在使用，其MDS－RA和RAEB類型在臨床診斷和治療中更易見。

婆羅雙樹樣基因4(SALL4)是最近研究發現的一種新的致癌基因，SALL4是婆羅雙樹樣基因家族的最新成員，最早是在果蠅體內發現的婆羅雙樹樣基因之一，SALL4是具有多個C2H2結構的序列的一種蛋白轉錄因子［5］。有研究表明SALL4在生殖細胞腫瘤、肝樣胃癌等腫瘤疾病的發生、發展和轉歸有重要意義［6，7］。而到目前為止，國內外對對MDS患者體內SALL4基因及其蛋白表達的研究報道較少。本研究主要采用PCR方法對臨床較為常見MDS－RA和RAEB類型的MDS患者的外周SALL4 mRNA的表達情況進行了檢測，以初步探討MDSRA和RAEB類型的MDS患者SALL4mRNA表達水平及其臨床意義。

1　資料和方法

1.1一般資料

選擇2012－12～2014～09在我院血液科就診的40例骨髓增生異常綜合征(MDS)患者其中男21例，女19例，年齡36～74歲，平均54.3歲。其中收集難治性貧血(MDS－RA)患者13例，難治性貧血伴原始細胞增多(MDS－RAEB)患者27例，所有患者診斷依據張之南主編的《血液病學》的MDS診斷標準確診［1］。隨機選取健康體檢人11例作為對照組，其中男7例，女4例，年齡30～57歲。

1.2主要材料及試劑

PCR擴增儀(美國BIO－BAD公司) ;穩壓穩流電泳槽(北京六一實驗儀器廠) ;超凈工作臺(蘇州凈化廠) ; 0.02% EDTA(Sigma，美國) ; MarkerDL50(武漢博士德) ; cDNA第一鏈合成試劑盒、RT－PCR擴增試劑盒(天津市灝洋生物)。

1.3骨髓樣本的處理

在無菌條件下取患者和健康查體的3mL新鮮骨髓液加入含肝素的抗凝管中，首先滴加適量PBS液稀釋，再次加入Ficoll淋巴細胞分離液(體積比1: 1混合)，混合均勻后離心(1500rpm)，離心20min，棄上清液后，留取中間白膜層的單個核細胞，取中間層液體再次加入PBS緩沖液沖洗，混合均勻后離心(2000rpm0，離心10min，留中間層后加入PBS緩沖液沖洗后放置于－80℃冰箱保存備用。

1.4 RNA的提取和cDNA合成

取上述標本，加入500μL的Trizol反復震蕩搖勻、靜置5min后加入0.2mL氯仿、1200rpm低溫離心15min，取上清液加入等體積異丙醇混合均勻，30min后再次低溫離心，棄上清加入75%乙醇震蕩后再次低溫7500rpm離心10min，棄上清部分檢測RNA濃度，其余RNA置于－40℃保存備用。

取上述獲得RNA標本產物，參閱文獻［8］中相關經驗，嚴格按照cDNA合成試劑盒說明書進行逆轉錄，獲得的cDNA產物置于－40℃冰箱保存備用。

1.5 PCR反應

(1)反應體系取25uL反應液其包括:逆轉錄產物(cDNA) 2μL，上游引物和下游引物各1μL、Magic-Mix液12.5μL;其余用蒸餾水配置至25μL。(2) SALL4基因的擴增反應條件為:開始95℃變性4min，其次95℃變性30s，再次61℃退火30s，緊接著72℃延伸1min，方法同上進行35個循環后72℃延伸5min，反應結束。(3)β－actin的擴增條件同SALL4基因過程。

表1　引物詳情

1.6統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件處理，統計描述用均數±標準差(±s)表示，不同組別間采用單純性方差分析，(P＜0.05)表示有統計學意義。

2　結果

SALL4 mRNA在MDS－RAEB、MDS－RA、正常對照組的表達及其ODR值SALL4 mRNA RT－PCR產物大小為282bp，內參β－actin為127bp，其基因表達產物泳帶見圖1。SALL4基因在正常對照組無表達未見電泳條帶;在MDS－RAEB和MDS－RA組中可見表達，其電泳條帶清晰，但是MDS－RAEB組表達較MDS－RA組高。見圖1。

通過其quelity one灰度分析軟件對所有條帶進行灰度分析SALL4基因與β－actin基因擴增產物電泳帶的灰度比值(ODR)發現，正常對照組SALL4mRNA相對ODR值與MDS－RAEB組、MDS －RA組比較，差異有統計學意義(P＜0.05) ; MDS －RAEB組較MDS－RA組相比較明顯較高(P＜0.05)，差異有統計學意義。見圖2。

圖1　各組患者RT－PCR電泳

圖2　實驗組中SALL4 /β－actin比值(ODR值) 注:*表示P＜0.05

3　討論

MDS在各年齡段人群均可發病，其中以老年居多，其每年發病率約為15/10萬～50/10萬，但是隨著醫療科學的發展和社會老齡化加其每年的發病率具有上升的趨勢［2］。由于目前對MDS的發病機制及其向急性白血病轉化的機制還不十分明確，導致目前對該病的診斷難度大，治療效果差。

SALL4是最新研究發現婆羅雙樹樣基因(SALL)家族中的致癌基因之一，該基因是果蠅Spalt的同源異型基因;有研究表明SALL4基因中含有4個外顯子，它們分別編碼后可產生兩種蛋白即SALL4A蛋白和SALL4B蛋白，該蛋白物質也具有婆羅雙樹樣基因家族成員結構相似［5］。有研究發現LEF1和TCF4F能有效激活SALL4轉錄，從而激活經典的Wnt信號轉導通路，e－myc細胞周期蛋白D1(CyclinD1)基質金屬蛋白酶7(MMP－7)為Wnt信號的靶基因在腫瘤發生發展過程中起重要的作用，提示SALL4基因具有導致腫瘤發生的潛能同時SALL4具有維持干細胞特性的作用和致瘤的潛能［9］。

有研究發現在很多生殖系統［10］(如卵黃囊瘤、無性細胞瘤、精原細胞瘤等腫瘤)中均發現SALL4異常表達;馬從乾［11］等人研究發現絕大多數的肝癌組織中SALL4的蛋白呈現高表達; SALL4的表達量與患者性別、年齡、腫瘤大小等因素無相關性。有學者通過SALL4轉基因小鼠模型研究發現［12］，在過度表達的動物出生14～24d可見骨髓異常增生活躍現象同時也可見造血細胞過度凋亡現象，還在動物外周血中發現紅系和粒系數量的減低;在實驗動物出生后6～8個月時可見很多未成熟的原始細胞、血小板、有核紅細胞等表現，這些均為典型的MDS樣病態造血相，此時還可見約有半數的實驗動物最終轉化為了急性白血病。然而又有學者在白血病中研究SALL4基因證實，SALL4蛋白可以通過與組蛋白脫乙酰酶(HDAC)進行復雜的一些列的反應過程后可抑制PTEN，進而促進白血病的進一步發展;在實驗中他們加入一種活性肽來拮抗抑制SALL4蛋白與組蛋白脫乙酰酶的反應，可以有效的解除對PTEN抑制，促進了具有SALL4蛋白高表達的惡性腫瘤細胞凋亡［13］。

本實驗主要是通過RT－PCR方法測定MDS患者骨髓的單個核細胞標本中SALL4 mRNA含量，本實驗研究發現正常對照組樣本中PCR結果未見電泳條帶，這也說明正常對照組的骨髓單個核細胞中SALL4 mRNA基本未見表達，而在在MDS－RAEB 和MDS－RA組中可見表達，其電泳條帶清晰可見，但是MDS－RAEB組中SALL4 mRNA含量灰度值較MDS－RA組高，這也說明在MDS組實驗樣本的骨髓單個核細胞中ALL4 mRNA呈現高表達水平，這與對照組比較有明顯的統計學差異(P＜0.05)，這正與段夢夕［14］和丁柳美等［15］人的研究結果基本一致。丁柳美等人研究發現MDS患者的外周血和骨髓中SALL4mRNA表達均明顯高于對照，且骨髓標本較外周血標本表達強;他們還在MDS各亞型中研究發現，各亞型之間有統計學差異，且在RAEB－Ⅰ及RAEB－Ⅱ這兩個亞型標本中具有較強的表達。然而本實驗則是把MDS中的RA與RAEB兩種臨床中最常見的亞型進行比較，本實驗研究發現MDS－RA組患者骨髓樣本中SALL4 mRNA含量表達水平明顯高于正常對照組患者骨髓樣本中表達量，MDS－RAEB組患者骨髓樣本中SALL4 mRNA含量表達水平高于MDS－RA組，差異有統計學意義(P＜0.05)。上述實驗研究結果提示了SALL4基因在正常對照組和MDS中RAEB－Ⅰ和、RAEB－Ⅱ這兩個亞型之間表達存在明顯差異，這對于臨床上MDS的診斷和分型提供了實驗依據，SALL4基因的檢測將來可能作為判斷骨髓增生異常綜合征患者發病及其協助分型的指標之一。

目前對于SALL4基因功能和引起MDS發生機制的研究目前仍然處于初級階段，雖然有文獻研究表明，SALL4基因在MDS患者身上可以檢測到該基因的表達有一定的相關性。本實驗深入地探討SALL4基因在MDS常見亞型中表達情況，對于探討MDS的具體發病機制及今后更準確地診斷和靶向治療惡性血液病提供潛在的新途徑。本實驗研究雖然發現SALL4基因在對照組無表達，MDS－RAEB組和MDS－RA高表達，且前者高于后者;但是本次實驗由于收集測定的標本較少、其他分型也未檢測，未連續進行病例跟蹤檢測，因此我們需要進一步擴大實驗樣本填補實驗樣本的偏少帶來的不足。

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Detection of SALL4 mRNA expression in myelodysplastic syndrome by RT－PCR

WU Guang－hai1，2，TIAN Li－ming1，YU Guang－qing1，ZHANG Chun1，YUAN Jia－yi1，SHEN Fu－guo1
(1.The First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154003，China; 2.The Eemergency Center of Hegang People’s Hospital，Hegang 154100，China)

Abstract:Objective: To investigate the expression of SALL4 mRNA and its clinical significance on myelodysplastic syndrome (MDS) patients with bone marrow SALL4 mRNA Expression and clinical significance.Methods: RT－PCR，13 cases were detected in patients with refractory anemia (MDS－RA).，27 patients with refractory anemia with excess blasts in patients (MDS－RAEB) and 11 cases of normal bone marrow mononuclear cells (BMMNC ) in SALL4mRNA expression and compared expression differences between MDS－RA and MDSRAEB betwee.Results: SALL4 mRNA expression in MDS patients were significantly higher than that in the control group.，aAnd MDS－RAEB higher expression of MDS－RA，the difference was statistically significant (P＜0.01).Conclusion: SALL4mRNA gene may be involved in the pathogenesis of MDS，SALL4 gene expression between differences MDS－RA and MDS－RAEB may suggest different pathogenesis.between two persons may suggest different pathogenesis.

Key words:SALL4mRNA; myelodysplastic syndrome; RT－PCR

(收稿日期:2015－03-04)

通訊作者:田黎明(1962～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫師，碩士研究生導師。E－mail: TLM3388@163.com。

作者簡介:①武廣海(1975～)男，黑龍江鶴崗人，在讀碩士研究生。

中圖分類號:R551.3

文獻標識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－0096－03