糖尿病性ED大鼠陰莖海綿體平滑肌中CaSR的表達①

秦文波，張　鵬，武　寧，李　璐

(1.佳木斯大學附屬第二醫院泌尿外科，黑龍江佳木斯154002;2.鄭州市第七人民醫院兒科，河南鄭州450000)

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糖尿病性ED大鼠陰莖海綿體平滑肌中CaSR的表達①

秦文波1，張鵬1，武寧1，李璐2

(1.佳木斯大學附屬第二醫院泌尿外科，黑龍江佳木斯154002;2.鄭州市第七人民醫院兒科，河南鄭州450000)

摘要:目的:觀察CaSR在糖尿病性勃起功能障礙(Diabetes mellitus－induced erectile dysfunction，DMED)大鼠陰莖海綿體平滑肌內的表達，揭示其與勃起功能障礙的關系。方法: 3月齡雄性Wistar大鼠(動物實驗中心)隨機分成3組:正常對照組、糖尿病模型組、糖尿病NPS2390組。采用ICP檢測3組大鼠陰莖海綿體壓力變化、采用免疫熒光法觀察海綿體組織CaSR蛋白表達。HE染色法觀察陰莖海綿體毛細血管數。結果:正常大鼠的陰莖海綿體平滑肌細胞有CaSR蛋白表達，且與正常對照組比較，糖尿病模型組和糖尿病NPS2390組大鼠陰莖海綿體組織CaSR蛋白含量增加(P＜0.01)，而陰莖海綿體毛細血管數減少(P＜0.01) ;且與糖尿病模型組比較，糖尿病NPS2390組CaSR蛋白含量明顯減少(P＜0.01)，而陰莖海綿體毛細血管數明顯增加(P＜0.01)。結論: CaSR有在陰莖海綿體平滑肌表達; CaSR參與了大鼠DMED的發生。

關鍵詞:糖尿病;勃起功能障礙;鈣敏感受體。

勃起功能障礙(Erectiledysfunedon，ED)是指持續或反復不能勃起或者勃起狀態維持的時間不足以完成滿意的性生活。國外流行病學調查顯示，約7%～60%的男性患有程度不同的ED。而ED患者中，約40%患有糖尿病［1，2］。在男性糖尿病患者中發生ED的概率為未患有糖尿病ED的3～6倍［3，4］。對于糖尿病ED，其發生機制復雜，尚未完全清楚，缺少有效的治療手段，已成為男性學科的熱點。鈣敏感受體(calcium－sensing receptor，CaSR)屬G蛋白偶聯受體C家族成員(該家族成員還包括mGluR、GABAb受體和信息素受體)。1993年，Brown EM等人在牛甲狀腺中首次克隆出了CaSR［5］。2003年，Wang等［6］首次證實在大鼠心肌組織中存在著CaSR。而關于在陰莖海綿體平滑肌細胞有無CaSR的功能表達及其病理生理意義，目前相關報道很少。因此，本實驗通過DMED模型的建立，及NPS2370的干擾，初步探討CaSR與勃起功能障礙的關系。

1　材料與方法

1.1實驗動物及材料

SPF(Specific pathogen Free，SPF)級純系3月齡雄性Wistar大鼠(佳木斯大學動物實驗中心提供) 40只，體重180～230g。STZ購自北京市博愛科貿有限責任公司，NPS2390購自美國Sigma公司，阿撲嗎啡購自美國Sigma公司，兔源CaSR多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，FITC標記山羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司，抗熒光淬滅劑購自武漢博士德生物工程有限公司，考馬斯亮藍試劑盒購自南京建成生物工程研究所，PBS液購自佳木斯大學實驗室。

1.2實驗方法

1.2.1實驗動物模型建立及分組

(1)正常對照組: 10只，僅經腹腔注射檸檬酸鈉－檸檬酸緩沖液(30mg/kg) ; (2)糖尿病模型組: 10只，除對照組外大鼠高脂高糖飲食4w后，禁食16～18h，30只大鼠經腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ)溶液(30mg/kg)，3d后，尾靜脈取血，測空腹血糖，并觀察大鼠禁食情況、飲水、尿量及體重變化。有多飲、多食、多尿、消瘦且血糖持續3周≥16.67mmol/L為造模成功未達標準者淘汰。將成模20只大鼠隨機分為糖尿病模型組和糖尿病NPS2390(CaSR激活劑)組; (3) :糖尿病NPS2390組:另每周經尾靜脈注射NPS2390(100mg/kg)二次。

1.2.2 APO實驗

選擇一安靜的房間，在每只大鼠頸項背部皮下注射阿樸嗎啡(100μg/kg)。注射以后觀察每只大鼠在1h內有沒有陰莖勃起，是否有張嘴反應并予以記錄。龜頭充血或陰莖體勃起成角大于90°記錄為1次勃起。以每組中有陰莖勃起的大鼠的百分比為勃起率。

1.2.3陰莖海綿體中蛋白測定(考馬斯亮藍法測定)

(1)標準曲線測定法:取6只試管，1只做為空白對照，僅加入蒸餾水1.0mL，其余5只分別加入不同體積以及濃度為100μg/mL牛血清白蛋白的標準液，添加蒸餾水至1.0mL。再在每只試管內分別加入考馬斯亮藍G－250試劑5.0mL，蓋上塞子，震蕩，靜置5min后在紫外線下在分光光度計585nm處測定吸光值。以牛血清清蛋白標準液的含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

(2)蛋白樣品:備100ug/mL的待測陰莖海綿體勻漿溶液。取一只試管做為空白對照，只添加蒸餾水1.0mL，一支加入0.5mL待測液，補充蒸餾水到1.0mL。然后每支試管均加入5.0mL考馬斯亮藍G－250試劑，蓋上塞子，震蕩，靜置10min，在585nm處，用紫外可見分光光度計測定吸光值。用測得的結果從標準曲線上查得相當于牛血清清蛋白的數量，計算得出待測陰莖海綿體勻漿溶液中蛋白質的含量。為減小測定誤差，測定中，每一個濃度標準蛋白質和待測蛋白質樣品需做3支平行管。根據所測樣品的吸光度值，結合標準曲線，查出相應的蛋白質含量(μg)，按下式計算:

樣品蛋白質含量鮮重= (查得的蛋白質含量×提取液總體積) /(樣品鮮重×測定時取用提取液的體積)

1.2.4 HE染色觀察陰莖海綿體組織毛細血管數目

采用蘇木素－伊紅(Hematoxylin and eosin，HE)染色觀察陰莖海綿體血管:取大鼠陰莖海綿體做常規石蠟切片，對標本HE染色，對比二者改變。每張切片隨機選取20個不同視野，鏡下計錄毛細血管數目。

1.2.5激光共聚焦顯微鏡熒光分析

(1)常規脫蠟至水:放入二甲苯Ⅰ20min、二甲苯Ⅱ20min→100%酒精Ⅰ10min、100%酒精Ⅱ10min→95%、90%、80%、70%酒精各10min→蒸餾水2min三次。

(2)熱修復抗原:放入0.01M枸椽酸鹽緩沖液(pH =6.0)中，在微波爐加熱下至液體沸騰后，自然冷卻至室溫，反復1次(10min后)，PBS(pH 7.2～7.6)洗滌5min，3次。

(3)抗原修復液修復:滴加抗原修復液，濕盒置于37℃恒溫水浴箱中孵育15min，之后PBS洗滌5min，3次。

(4)血清封閉:用紙巾吸干組織周圍多余液體，擺放濕盒中，滴加血清封閉，濕盒置于37℃恒溫水浴箱中孵育20min，不洗。

(5)加一抗:滴加CaSR抗體于切片上，濕盒置于4℃冰箱過夜。

(6)取出濕盒恢復室溫30min，之后PBS洗滌5min，3次。

(7)滴加熒光標記二抗:濕盒置于37℃恒溫水浴箱孵育90min。PBS洗滌5min，3次。

(8)激光掃描共聚焦顯微鏡取圖，取圖條件:激發光波長: 488nm;掃描方式: xyz;物鏡: 20倍干鏡(NA為0.75) ;激光功率: (20±2) mw;掃描強度: 50%;光電倍增管的增益(PMT) : 852;探測針孔: 2.02;掃描次數: 4。

1.3統計學方法

采用SAS(9.13版)軟件處理實驗數據，調用Proc GLM過程進行方差分析，各實驗組與對照組的比較采用dunnet t檢驗，P＜0.01表示有統計學意義，保留且進行相關分析。

2　結果

2.1勃起次數及勃起率測定

與正常對照組比較，糖尿病模型組和糖尿病NPS2390組陰莖勃起次數和勃起率均降低;與正常組相比較，糖尿病組陰莖勃起次數和勃起率明顯降低，而糖尿病NPS2390組相比較有所回升，與正常組非常接近，見表1。

表1　各組勃起率的變化情況(±s，n =10)

表1　各組勃起率的變化情況(±s，n =10)

組別　　勃起次數　　勃起率(%)正常對照組　3.5±0.4　100(10/10)糖尿病模型組　2.2±0.3　60(6/10)糖尿病NPS2390組　3.2±0.2　90(9/10)

2.2免疫熒光檢測大鼠陰莖海綿體平滑肌鈣敏感

受體蛋白的表達

與正常對照組比較，糖尿病模型組和糖尿病NPS2390組大鼠陰莖海綿體平滑肌組織鈣敏感受體蛋白表達增加(P＜0.01)，且糖尿病模型組與糖尿病NPS239組比較，大鼠陰莖海綿體平滑肌組織鈣敏感受體蛋白表達明顯增加，差異有顯著性(P＜0.01)，見表2，圖1～3。

表2　大鼠陰莖海綿體組織鈣敏感受體蛋白表達(±s，n =10)

表2　大鼠陰莖海綿體組織鈣敏感受體蛋白表達(±s，n =10)

組別　　熒光強度(means±s.e.m)正常對照組1.09±0.03糖尿病模型組　1.72±0.08糖尿病NPS2390組1.23±0.05

2.3大鼠陰莖海綿體組織中毛細血管數目檢測

與正常對照組比較，糖尿病模型組和糖尿病NPS2390組大鼠陰莖海綿體組織中毛細血管數目減少(P＜0.01)，且糖尿病模型組與糖尿病NPS2390組比較，大鼠陰莖海綿體組織中毛細血管數目明顯減少，差異有顯著性(P＜0.01)。

表3　各組大鼠陰莖海綿體組織中毛細血管數目(±s，n =10)

表3　各組大鼠陰莖海綿體組織中毛細血管數目(±s，n =10)

組別　　毛細血管數目(根/HP)正常對照組13.90±3.40糖尿病模型組　8.20±2.30糖尿病NPS2390組11.35±1.50

圖1　正常對照圖CaSR蛋白表達(免疫熒光，×600)

圖2　糖尿病模型組CaSR蛋白表達(免疫熒光，×600)

圖3　糖尿病NPS2390組蛋白表達(免疫熒光，×600)

3　討論

陰莖勃起的基礎是陰莖海綿體平滑肌的舒張。眾多證據提示，與其他血管組織一樣，陰莖海綿體平滑肌緊張性的主要調節物質是鉀通道、鈣通道。而Ca2 +是觸發肌細胞收縮的關鍵介質，其阻滯細胞內［Ca2 +］i的升高是導致平滑肌松弛的有效途徑。綜上所述，研究陰莖海綿體平滑肌細胞膜鈣通道對ED的發生機制有至關重要的作用［7］。鈣敏感受體(calcium－sensing receptor，CaSR)是G蛋白耦聯受體的C家族成員。由Brown et al于1993年首次于牛甲狀旁腺克隆出CaSR。CaSR的主要作用是維持Ca2 +和其他金屬離子穩態，也可調節細胞增殖、分化、離子通道開啟、激素分泌等。細胞外Ca2 +是CaSR的主要配體，而Mg2 +、Gd3 +、新霉素、精胺(spermine)等多價陽離子亦可是CaSR的激動劑［8］。實驗首先建立糖尿病大鼠模型，通過APO (100μg/kg)進行陰莖勃起，結果顯示糖尿病模型組陰莖勃起次數和勃起率降低，同時經尾靜脈注射NPS2390(CaSR抑制劑)后，改善海綿體內壓的降低。可知由STZ誘發的DM可影響雄性大鼠的性功能，并可導致DMED，CaSR的激活顯著影響了糖尿病大鼠的性功能，進一步加重了DMED的發生。采用免疫熒光檢測大鼠陰莖海綿體平滑肌CaSR蛋白的表達。與正常對照組比較，糖尿病模型組大鼠陰莖海綿體平滑肌組織中CaSR蛋白表達增加，而糖尿病NPS2390組增加不明顯。且通過免疫熒光實驗進一步證實了大鼠陰莖海綿體組織中CaSR的存在以及DMED時陰莖海綿體中CaSR表達增加。

本課題還研究了CaSR與大鼠陰莖海綿體毛細血管的關系，制取大鼠陰莖海綿體做石蠟切片，HE染色，觀察陰莖海綿體毛細血管數，并對比兩者改變。結果示:與正常組相比較，糖尿病及糖尿病NPS2390組的血管數目較低，并且糖尿病組的血管數目減低明顯，兩組比較有顯著的差異性。因此，2型糖尿病時NPS2390抑制CaSR后可遏制陰莖海綿體毛細血管的減少，緩解海綿體血供不足的問題，進而參與DMED的發生。由此可知，CaSR在DMED的發生發展中發揮重要作用。但對于該過程的具體調控和相關的分子機制以及是否涉及其它信號分子，是否還有其他途徑的參與，還需更深入的研究。

參考文獻:

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［7］González－Corrochano R，La Fuente JM，Cuevas P，et al.Ca2 +－activated K+channel (K(Ca) ) stimulation improves relaxant capacity of PDE5 inhibitors in human penile arteries and recovers the reduced efficacy of PDE5 inhibition in diabetic erectile dysfunction ［J］.Br J Pharmacol，2013，169(2) : 449－461

［8］Brown EM，MacLeod RJ.Extracellular calcium sensing and extracellular calcium signaling［J］.Physiol Rev，2001，81(1) : 239－297

(收稿日期:2015－01－04)

通訊作者:張鵬(1981～)男，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生，主治醫師。E－mail: zhangpeng1981@163.com。

作者簡介:①秦文波(1956～)男，黑龍江寶清人，學士，教授，碩士研究生導師。

中圖分類號:R587.1

文獻標識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－00102－03