葡萄糖酸鈣、尼莫地平預(yù)處理對大鼠彌漫性軸索損傷后早期ELISA Kit含量變化的影響①

何偉明，李英夫，楊福義

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市科爾沁區(qū)第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，內(nèi)蒙古通遼028000;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，黑龍江佳木斯154003)

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葡萄糖酸鈣、尼莫地平預(yù)處理對大鼠彌漫性軸索損傷后早期ELISA Kit含量變化的影響①

何偉明1，李英夫2，楊福義2

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市科爾沁區(qū)第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，內(nèi)蒙古通遼028000;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，黑龍江佳木斯154003)

摘要:目的:通過對葡萄糖酸鈣，尼莫地平預(yù)處理的大鼠建立彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury，DAI)模型，并檢測其血液中不同時間點(diǎn)的人神經(jīng)絲蛋白(NF) ELISA Kit的含量，以觀察葡萄糖酸鈣，尼莫地平預(yù)處理對病理演變過程的影響。方法:選健康Wistar大鼠55只，雌雄不限，體重250～300g，隨機(jī)分成對照組、葡萄糖酸鈣組、尼莫地平組。分別給予相關(guān)喂養(yǎng)一周，自制mararous A氏致傷裝置建立彌漫性軸索損傷動物模型，采用心臟取血的方式分別于6h、24h時采集血液標(biāo)本。通過酶聯(lián)免疫法測量血液樣本中人神經(jīng)絲蛋白含量。結(jié)果:葡萄糖酸鈣預(yù)處理組大鼠DAI后血(NF) ELISA Kit含量比對照組明顯降低尼莫地平預(yù)處理組大鼠DAI后血清(NF) ELISA Kit含量比對照組明顯降低。結(jié)論:在中、輕型腦外傷患者血腦屏障仍然存在，患者保留了正常調(diào)節(jié)機(jī)制的基礎(chǔ)上，維持相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，維持相對穩(wěn)定的細(xì)胞內(nèi)外的鈣離子濃度差，維持正常跨膜電位，對防止皮質(zhì)神經(jīng)元去極化所導(dǎo)致的鈣離子大量內(nèi)流，及由此繼發(fā)性引起的鈣離子依賴性酶促反應(yīng)群。對降低或減少DAI后的軸索斷裂，有著不可低估的實(shí)際意義。

關(guān)鍵詞:彌漫性軸索損傷;人神經(jīng)絲蛋白;葡萄糖酸鈣;尼莫地平

外傷性腦損傷(traumic brain injury，TBI)可以分為局灶性腦損傷和彌漫性腦損傷兩種類型，而彌漫性腦損傷中彌漫性軸索損傷(diffuse axonalinjury，DAI)是在剪應(yīng)力的作用下所引起的以腦白質(zhì)軸索斷裂、軸索收縮球形成為主要特征的一種彌漫性腦損傷。是導(dǎo)致顱腦傷患者死亡、植物生存和嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙的最主要原因。病死率高［1，2］日益受到臨床學(xué)者的重視。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物和分組

選健康Wistar大鼠55只，雌雄不限，體重250 ～300g，隨機(jī)分組。(鼠源由佳木斯大學(xué)學(xué)校動物中心提供)。

分為:對照組，尼莫地平組，葡萄糖酸鈣組。其中對照組15只，給予正常飼養(yǎng)。尼莫地平組20只，給予尼莫地平注射液按5%比例混入鼠糧，飲水中喂養(yǎng)。葡萄糖酸鈣組20只，給予10%葡萄糖酸鈣注射液按5%比例混入鼠糧，飲水中喂養(yǎng)。一周后，麻醉后統(tǒng)一造模，每只間隔時間為5min，并按順序編號。按時間順序分別在6h、24h兩個時間點(diǎn)麻醉后處死，直接刺人心臟抽吸血液。

1.2動物模型的制作

各組大鼠于手術(shù)前12h禁食，自由飲水。參照Marmarou A的方法制作大鼠彌漫性軸索損傷模型。根據(jù)打擊后不同時間處死。

1.3直接心臟抽吸血液

按致傷時間，用10%水合氯醛300～350mg腹腔注射(0.35mL/100g)麻醉。滿意后，將大鼠動物仰臥固定在固定板上，剪去心前區(qū)部位的鼠毛，消毒皮膚。在左側(cè)第3～4肋間，用左手食指摸到心搏處，右手取連有4～5號針頭的注射器，選擇心搏最強(qiáng)處穿刺，迅速而直接插入心臟，避免心臟將從針尖處滑脫;如第一次沒刺準(zhǔn)，將針頭抽出重刺，4℃存放，然后統(tǒng)一3000r/min離心10min充分析出血清。處理后的大鼠處死。

1.4神經(jīng)纖維細(xì)絲蛋白(NF) ELISA Kit測定及計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo))，OD值為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo))，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，分別將葡萄糖酸鈣組，尼莫地平組與對照組進(jìn)行比較，組間的比較采用配對樣本t檢驗(yàn)，置信區(qū)間為95%。P＜0.05有顯著性差異。

2　結(jié)果

葡萄糖酸鈣、尼莫地平預(yù)處理大鼠彌漫性軸索損傷后，6h和24h血中人神經(jīng)絲蛋白含量的變化，葡萄糖酸鈣、尼莫地平組均有顯著變化，見表1。

表1　葡萄糖酸鈣，尼莫地平預(yù)處理對大鼠彌漫性軸索損傷后早期人神經(jīng)絲蛋白含量變化

3　討論

DAI作為一個獨(dú)立的疾病由Adams［5］等于1982年正式命名以來，已被神經(jīng)外科學(xué)界所接受，但目前對其發(fā)病機(jī)理仍有爭論。多數(shù)研究者認(rèn)為當(dāng)頭部受到強(qiáng)大的外力作用后，產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)加速度，進(jìn)而使腦組織內(nèi)產(chǎn)生一定的剪力，是發(fā)生DAI的主要力學(xué)機(jī)制［3，4］。

在旋轉(zhuǎn)損傷中，產(chǎn)生延遲昏迷的腦損傷往往沒有顱內(nèi)局灶性、擴(kuò)展性病灶，且不伴有顱內(nèi)高壓，但可以有輕微的腦表面挫傷和小量的蛛網(wǎng)膜下腔及硬膜下腔出血。即由于外傷使腦組織內(nèi)部易發(fā)生剪力作用，即對軸突起橫向作用的剪力和(或)對軸突起縱向作用的張力是否超出軸突的承受限度，是導(dǎo)致神經(jīng)軸索和小血管損傷的關(guān)鍵。根據(jù)這一原理制成的動物模型也成功模擬了臨床所見的DAI［6］。

DAI具體的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。而鈣離子一直被認(rèn)為在DAI神經(jīng)元的變性及死亡中起到關(guān)鍵性作用。正常細(xì)胞外Ca2 +濃度比細(xì)胞內(nèi)高得多。Ca2 +在細(xì)胞生命活動中有第二信使之稱，參與信息傳遞、遞質(zhì)及激素的釋放、軸突運(yùn)輸、細(xì)胞運(yùn)動等。細(xì)胞外鈣向細(xì)胞內(nèi)移動有以下四種途徑:一是由于電位差使鈣離子自外向內(nèi)移;二是借鈣離子受體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi);三是通過細(xì)胞膜濃度差順向移動;四是細(xì)胞內(nèi)鈣離子與細(xì)胞外鈣離子交換。盡管有四種途徑可使細(xì)胞外鈣向細(xì)胞內(nèi)移動，但是細(xì)胞內(nèi)鈣濃度依然很低。真核細(xì)胞內(nèi)Ca2 +濃度小于胞外。其原理與鈉鉀泵相似。Ca2 +泵水解1個ATP可轉(zhuǎn)運(yùn)2個Ca2 +，并伴有1個Mg2 +反向轉(zhuǎn)運(yùn)。以維持細(xì)胞內(nèi)較低的鈣離子濃度。血鈣主要指血漿鈣。在機(jī)體多種因素的調(diào)節(jié)和控制下，血鈣濃度比較穩(wěn)定，正常值2.25～2.75mmol/L。血漿鈣中只有離子鈣才直接起生理作用。這類反應(yīng)主要是鈣調(diào)節(jié)蛋白與鈣結(jié)合使鈣內(nèi)流增加，造成細(xì)胞膜的復(fù)極化，或激活酶系統(tǒng)，改變代謝水平或代謝方向，產(chǎn)生相應(yīng)的生理反應(yīng)［7］，當(dāng)前研究已發(fā)現(xiàn)DAI后鈣離子超載的機(jī)制主要有:軸膜損傷導(dǎo)致的通透性改變;電壓門控鈉通道(NaCh)功能障礙;神經(jīng)興奮性毒作用及線粒體損傷等.近來研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元的鈣離子超載一方面是由于細(xì)胞外鈣離子的內(nèi)流發(fā)揮了重要作用，另一方面神經(jīng)元鈣庫尤其是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的鈣離子釋放也可能發(fā)揮了重要作用。在多種病理狀態(tài)下.細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高可導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡［9］。

軸索損傷并非受傷當(dāng)時立即出現(xiàn)，而是漸進(jìn)性的，損傷越重，軸索損傷出現(xiàn)的速度越快，DAI是一個逐漸演化的軸索內(nèi)變化過程，軸索腫脹是進(jìn)行性的，傷后12～24h才發(fā)生軸索斷裂。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí).隨剪應(yīng)力增大或剪應(yīng)力作用時間延長。可造成細(xì)胞較大的變形，說明機(jī)械力大小直接影響細(xì)胞反應(yīng)的嚴(yán)重程度。DAI的剪應(yīng)力作用與神經(jīng)元軸膜會導(dǎo)致機(jī)械性變形，從而誘導(dǎo)軸膜的膜孔產(chǎn)生，因而軸膜通透性增高.正常狀態(tài)下不能進(jìn)入軸膜及正常狀態(tài)下限制于軸膜內(nèi)的分子此時可以出入。存這種高通透性下，Ca2 +在細(xì)胞內(nèi)迅速的聚集。因而基于上述研究發(fā)現(xiàn).Kiline等［10］認(rèn)為機(jī)械損傷導(dǎo)致的軸膜損傷是DAI發(fā)生機(jī)制的關(guān)鍵。

DAI后.神經(jīng)元胞漿內(nèi)鈣離子濃度升高，使得跨膜電位減弱，從而一方面使得線粒體將ATP用于質(zhì)膜上的鈣泵將鈣離子泵入線牲體內(nèi)從而維持線粒體的跨膜電位，同時使得ATP合成減少。線粒體內(nèi)高鈣離子濃度及線粒體跨膜電位降低誘導(dǎo)開放了線粒體內(nèi)膜上的線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrion permeability transition pore.MPTP)，使得線粒體內(nèi)膜具有較高的通透性，線粒體的電子鏈功能異常。H+從線粒體內(nèi)漏出。這些因素使得活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的大量產(chǎn)生。通過氧化應(yīng)激作用加劇了神經(jīng)元鈣離子的聚集。

對于DAI后細(xì)胞內(nèi)鈣離子的動態(tài)平衡被打破是產(chǎn)生繼發(fā)神經(jīng)元損傷或死亡的基礎(chǔ)。故此，我們設(shè)計(jì)了上述實(shí)驗(yàn)，以觀察葡萄糖酸鈣，尼莫地平預(yù)處理對病理演變過程的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在DAI 后6h，鈣劑預(yù)處理組的(NF) ELISA Kit含量明顯低于鈣離子拮抗劑組及對照組。

我們認(rèn)為:在中、輕型腦外傷患者血腦屏障仍然存在，患者保留了正常調(diào)節(jié)機(jī)制的基礎(chǔ)上，維持相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，維持相對穩(wěn)定的細(xì)胞內(nèi)外的鈣離子濃度差，維持正常跨膜電位，對防止皮質(zhì)神經(jīng)元去極化所導(dǎo)致的鈣離子大量內(nèi)流，及由此繼發(fā)性引起的鈣離子依賴性酶促反應(yīng)群。對降低或減少DAI后的軸索斷裂，有著不可低估的實(shí)際意義。

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(收稿日期:2015－11－18)

通訊作者:李英夫(1979～)男，黑龍江明水人，碩士，主治醫(yī)師。E－mail: 99656218qq.com。

作者簡介:①何偉明(1974～)男，內(nèi)蒙古通遼人，在讀博士研究生，主治醫(yī)師。

中圖分類號:R651.1+5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－0073－02