利用響應面法優化海洋微生物發酵產角鯊烯的研究*

王曉龍， 譚延振， 候路寬， 崔　球,4， 宋曉金, 李文利,**

(1.中國海洋大學海洋藥物教育部重點實驗室,醫藥學院,山東 青島 266003；

2.青島市單細胞油脂工程實驗室，山東 青島 266101；

3.中國科學院青島生物能源與過程研究所，山東省能源生物遺傳資源重點實驗室，山東 青島 266101；

4.中國科學院青島生物能源與過程研究所，中國科學院生物燃料重點實驗室，山東 青島 266101)

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利用響應面法優化海洋微生物發酵產角鯊烯的研究*

王曉龍1， 譚延振2,3， 候路寬1， 崔球2,3,4， 宋曉金2,3, 李文利1,**

(1.中國海洋大學海洋藥物教育部重點實驗室,醫藥學院,山東 青島 266003；

2.青島市單細胞油脂工程實驗室，山東 青島 266101；

3.中國科學院青島生物能源與過程研究所，山東省能源生物遺傳資源重點實驗室，山東 青島 266101；

4.中國科學院青島生物能源與過程研究所，中國科學院生物燃料重點實驗室，山東 青島 266101)

摘要：采用響應面法對海洋微生物Pseudozyma sp. SD301發酵產角鯊烯培養條件進行優化。在單因素實驗結果的基礎上，通過Design-Expert軟件對葡萄糖濃度、接種量、培養溫度、裝液量進行4因素響應面實驗設計，以角鯊烯產量為響應值，優化菌株Pseudozyma sp. SD301的培養條件，并驗證響應面預測值與實測值的一致性。結果表明，在葡萄糖濃度為67.2 g·L(-1)、接種量為1.5%、培養溫度為26℃、裝液量在41 mL/250 mL的最優培養條件下，角鯊烯產量為1.152 g·L(-1)，比出發條件提高了3.62倍，實測值與響應面預測值吻合良好。

關鍵詞:角鯊烯；發酵優化；Plackett-Burman；響應面優化

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角鯊烯(Squalene)是一種脂質不皂化物，其化學名稱為2, 6, 10, 15, 19, 23-六甲基-2, 6, 10, 14, 18, 22-二十四碳六烯，屬開鏈三萜。具有增強機體免疫能力、改善機體功能、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種生理功能[1]，是一種無毒性的具有防病治病作用的海洋生物活性物質，并廣泛應用于醫藥、美容、化妝品、食品等各個領域[2]。

角鯊烯擁有廣闊的應用前景，然而稀缺的來源極大地限制了其大規模生產和普及使用。目前深海鯊魚是市場獲取角鯊烯的主要途徑[3]。但是深海鯊魚是珍貴的海洋保護生物，大量捕殺會破壞海洋生態平衡，而且從鯊魚肝油中提取角鯊烯存在高成本及安全衛生問題。從植物獲取角鯊烯雖然來源廣泛，但是植物中角鯊烯含量低，而且植物產量深受季節和地域的影響[4]。總之天然來源角鯊烯已經遠遠不能滿足日益增長的市場需求和質量要求，工業化生產角鯊烯勢在必行。目前來說化學合成方法都存在不同程度的問題，不是歩驟過多、反應復雜；就是反應條件苛刻，條件實現難度大，化學合成角鯊烯目前僅限于實驗室的研究，實現工業化合成尚有距離[5]。所以解決角鯊烯來源的瓶頸問題，急需從微生物及其他方向上尋求突破[6]。

利用微生物發酵生產角鯊烯具有無可比擬的優勢。利用微生物生產角鯊烯產品質量優質、生產周期短、不受時間地域限制、生產工藝操作簡單、安全衛生，是工業生產角鯊烯的最佳選擇。因而利用微生物發酵獲取優質而廉價角鯊烯成為國際研究的熱點。其中破囊壺菌、微藻、酵母及類酵母是目前研究的重點。據報道在光合自養的條件下，一些微藻可以積累一定量的角鯊烯[7]，異養微藻Thraustochytrid也可以具有較高的角鯊烯含量，達到1.2mg·g-1[8]。菌株Aurantiochytriumsp.18W-13a是分離于日本沖繩的高產角鯊烯菌株，其產量可高達(1.29±0.13)g·L-1，是目前已知的角鯊烯產量最高菌株[9]。Elias Englund等[10]研究結果表明Synechocystissp.PCC 6803可以高效積累角鯊烯，拓寬了角鯊烯微生物來源的研究范圍。眾所周知基因工程改造是提高微生物產角鯊烯能力的重要手段。Garaiová M等[11]通過基因工程手段顯著改變釀酒酵母產角鯊烯能力，突顯出基因工程在改良菌株方面的強大優勢。Akinori Katabami等[12]人通過在EscherichiaColi中表達角鯊烯合酶，實現了角鯊烯在大腸桿菌中的表達，角鯊烯達到230mg·L-1。酵母及類酵母是本領域內已知的產角鯊烯量高的微生物，釀酒酵母、畢赤酵母、有孢圓酵母生產角鯊烯已被廣泛研究。Pseudozymasp.JCC207是一株分離自美國近海的類酵母菌株，實驗證實其可以高效生產角鯊烯，在優化條件下角鯊烯產量達到340.52mg·L-1，顯示出其巨大的工業潛力[13]。

研究室前期分離獲得一株可以產角鯊烯的類酵母菌株。利用Plackett-Burman與響應面方法優化其產角鯊烯的發酵條件，建立其高產角鯊烯的工藝方法。采用Plackett-Burman法可以通過較少的試驗次數，快速準確地從眾多變量間篩選出對響應值有顯著效應的因素，有效減少試驗考察因素及試驗次數。響應面方法(Response Surface Methodology, RSM)是一種在微生物發酵領域有廣泛應用的優化方法，其可以形象直接的顯示最優區域及最優點。本實驗采用響應面方法確定重要因素的最佳水平，利用Design expert軟件分析實驗數據，得出回歸模型和最佳發酵條件，并進行實驗驗證。最終得到利用Pseudozymasp. SD301發酵產角鯊烯的最佳發酵條件，為海洋微生物產角鯊烯工業化生產提供基礎。

1材料與方法

1.1 實驗材料及培養條件

Pseudozymasp. SD301菌株由中國科學院青島生物能源與過程研究所代謝物組學團隊研究室分離獲得，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為CGMCC No. 9687。種子培養基：葡萄糖20 g·L-1，酵母抽提物20 g·L-1，海水晶15 g·L-1；固體培養基加入瓊脂粉20 g·L-1。發酵培養基為葡萄糖60 g·L-1，酵母抽提物20 g·L-1，海水晶15 g·L-1。

菌株劃線于固體平板，25℃培養2d，接種于裝有一定體積的種子培養基的250mL搖瓶中，在25℃，200r·min-1的搖床培養一定時間后，種子液按一定比例接種至裝有一定體積的發酵培養基的250mL搖瓶中，于選定溫度及轉速的搖床上培養一定時間后，取發酵液30mL，4000g離心10min，收集菌體，菌體進行冷凍干燥稱重并分析角鯊烯含量。

1.2 角鯊烯的提取

角鯊烯的提取參照He[14]等的方法。將菌體磨碎后稱取適量菌體(約60 mg)，加入300μL 6mol·L-1HCl，室溫放置30 min，沸水浴5 min。冷卻后的溶液中加入900 μL氯仿甲醇(2∶1, v/v)，渦旋振蕩混勻，12000r·min-1離心5 min，收集下層液體，加入等體積飽和氯化鈉，離心取下相。旋轉蒸發除去溶劑，50℃真空干燥，得到油脂。加入2mol·L-1NaOH溶液，85℃反應1h，使油脂中的脂肪酸完全皂化。冷卻至室溫，加入適量飽和NaCl溶液和正己烷，振蕩并靜置分層。上相用0.22μm濾膜過濾，進行氣相色譜分析。

1.3 角鯊烯含量分析

氣相色譜條件為：采用Agilent 7890B氣相色譜，色譜柱型號為HP-5柱(30m×0.25mm×0.25μm)；載氣為高純氮氣，恒流模式，流速1.0mL·min-1；進樣體積為1μL，檢測器為氫離子火焰檢測器。升溫程序為：初溫100℃，以15℃·min-1升至300℃，保持6min。

角鯊烯(99%，J&K Scientific LTD)溶于色譜級正己烷，做響應峰面積-角鯊烯含量標準曲線(見圖1)。根據待測樣品中角鯊烯的響應峰面積測定角鯊烯含量。

圖1　角鯊烯濃度與峰面積標準曲線圖

角鯊烯產量計算公式：

Y=X×Z-1×M×0.03。

其中:Y為角鯊烯產量，單位 g·L-1；X為根據標準曲線得到的角鯊烯質量，單位g；Z為研磨后稱取的菌體干重，單位g；M為每次取樣(30mL)中菌體干重，單位g；0.03，為常數，表示每次取樣的體積，L。

1.4 實驗設計

1.4.1 Plackett-Burman實驗設計Plackett-Burman實驗設計參照Plackett的方法[15-16]。根據前期預實驗結果，確定影響角鯊烯發酵的可能因素，對各個因素進行全面考察，實驗設計中把每個因素設計成高(+1)和低(-1)2個水平。

1.4.2 中心組合實驗中心組合實驗參照Adinarayana等的方法[17-19]。采用中心組合設計(Central composite design, CCD)，對PB實驗篩選到的關鍵因子進一步研究，以獲得影響該菌發酵產角鯊烯的優化發酵條件。自變量按下式進行編碼變換：

Xi=(x-x0)/Δxi，i=1, 2, 3, …, K。

(1)

式中：Xi為自變量xi的編碼值，x0為自變量Xi在中心點的值，Δxi為自變量變化步長。用標準多項式回歸方法，對實驗數據進行擬合，便得到一個二次多項式，該方程為描述響應量(應變量)自變量關系的經驗模型。對于2因子系統，模型可描述為:

(2)

式中：Y為預測響應值；β0為截距；βi為線性系數；βii為平方系數；βij為交互作用系數。

2結果與分析

2.1 影響角鯊烯發酵的重要因素

根據前期預實驗結果，確定影響角鯊烯發酵的可能因素包括葡萄糖濃度、酵母抽提物濃度、培養時間、初始pH、培養溫度、接種量、轉速、裝液量、瓶型9個因素。為了對各個因素進行全面考察，設計進行了Plackett-Burman實驗。實驗設計中把每個因素設計成高(+1)和低(-1)2個水平。實驗設計見表1。

表1　N=12的Plackett-Burman實驗設計與結果

注：各符號表示含義X1，葡萄糖含量(g·L-1)；X2，酵母抽提物含量(g·L-1)；X3，培養時間(day)；X4，培養基初始pH值；X5，培養溫度(℃)；X6，初始接種量(%，V/V)；X7，轉速(rpm)；X8，裝液量(mL)；X9,瓶型。X1，Glucose concention(g·L-1);X2，Yeast extract concention(g·L-1); X3，Culture time(day); X4， Initial pH; X5， Culture temperature; X6， Inocultion quantity; X7， Rotate speed; X8， Loding; X9, Bottle type.

按表1設計進行2輪重復實驗，每輪設置3個平行。實驗結果取6次平均值，見表1中角鯊烯含量一欄。利用Design expert軟件進行分析各因素效益及重要性評價(見表2)。

對角鯊烯發酵過程有顯著影響(可信度大于75%，P<0.25)的因素包括葡萄糖含量、接種量、裝液量、培養溫度。其中葡萄糖、接種量、裝液量呈現正效應，培養溫度呈現副效應。葡萄糖、接種量對角鯊烯發酵具呈現正效應顯著影響，這是因為角鯊烯屬于胞內產物，其生物量能夠直接顯著影響其產物產量。同樣，在溫度超過其最適溫度后，高溫對其產生不良影響，抑制菌體生長，所以表現出負效應顯著影響。而裝液量能夠影響角鯊烯產量的原因可能是過少的裝液量造成過高的溶氧，使得胞內碳流向能量代謝等途徑轉移，最終影響角鯊烯產量。其余因素如初始pH值和培養時間對角鯊烯產量沒有顯著影響，說明本研究中使用的菌株具有良好低pH耐受性和生長迅速的特點，適合工業化生產。

綜合Plackett-Burman實驗結果可看出，要提高產角鯊烯產量，應該適當提高葡萄糖濃度、裝液量和初始接種量，降低培養溫度。各個因素最優值有待于進一步實驗考察。

2.2 響應面實驗優化發酵條件

2.2.1 模型的建立及分析按照數理統計的原理及分析的方法，參照Plackett-Burman實驗結果，選取影響最顯著的4個因素，葡萄糖、接種量、裝液量、培養溫度作為研究因素，每個因素選取3個水平，以角鯊烯產量做為評價指標，按照二次項回歸方程進行擬合，進行中心組合實驗。變量及每個水平對應值見表3。中心組合及其實驗結果見表4。

表2　各因素的主要效應

表 3　中心組合實驗中變量及其水平

注：各符號表示含義X1，葡萄糖含量(g·L-1)；X5，培養溫度(℃)；X6，初始接種量(%，V/V)；X8，裝液量(mL)。X1，Glucose concention(g·L-1); X5， Culture temperature(℃); X6， Inocultion quantity(%,v/v); X8， Loding(mL).

2.2.2 多元二次回歸方程的建立及顯著性檢驗應用Design-Expert V8.0.6軟件進行多元回歸擬合[20-21]對中心組合實驗數據進行分析，可得葡萄糖(X1)、培養溫度(X5)、接種量(X6)、裝液量(X8)與響應值角鯊烯產量(Y)的關系，其方程式為：

Y=0.12X1+0.047X5+0.0083X6+0.061X8+0.018X1X5+0.013X1X6-0.071X1X8-0.021X5X6-0.005X5X8-0.00199X6X8-0.12X12-0.18X52-0.086X62-0.13X82

回歸方差分析見表5，結果表明：模型決定系數R2=0.9678，葡萄糖(X1)、培養溫度(X5)、接種量(X6)、裝液量(X8)與響應值角鯊烯產量(Y)存在線性關系；F值為7.03(P<0.0005)，說明此模型高度顯著。因素葡萄糖(X1)對角鯊烯產量效應顯著，培養溫度(X5)、裝液量(X8)次之，接種量(X6)幾乎無影響;因素X1與X5對角鯊烯發酵交互作用顯著，而其他因素兩兩交互影響不顯著。

2.2.3 響應面分析及最優發酵條件的確定及驗證借助Design expert軟件依據回歸方程來繪制響應面立體分析圖，考察所擬合的相應曲面的形狀響應面立體圖如圖2所示。利用該組圖可以對影響角鯊烯的發酵條件中2種因素的交互效應進行分析和評價，并確定最佳因素水平范圍。

圖2A顯示葡萄糖和培養溫度之間交互影響的響應面圖。在本實驗水平范圍內，角鯊烯產量會隨著葡萄糖的濃度和培養溫度的取值水平而變化。當葡萄糖的濃度小于67g·L-1時，角鯊烯產量隨葡萄糖濃度升高而升高，當葡萄糖的濃度大于67g·L-1時，無論培養溫度為多少，角鯊烯產量都不會達到最大值。因此葡萄糖濃度應該控制在60～70g·L-1之間。培養溫度變化趨勢與葡萄糖濃度相似，比較適宜的培養溫度在24～28℃之間。

圖2B培養溫度與裝液量對角鯊烯產量的影響。由圖可見，培養溫度及裝液量的變化對角鯊烯產量影響非常明顯。前期隨著培養溫度的升高，角鯊烯產量不斷增加，到達峰值25℃時，隨著培養溫度的升高，角鯊烯產量逐漸減少；與之類似，前期隨著裝液量的增加，角鯊烯產量不斷增加，到達峰值約40mL時，隨著裝液量的升高，角鯊烯產量逐漸減少。因此，培養溫度在24～28℃，裝液量在40～45mL之間時，角鯊烯產量最高。

圖2C顯示葡萄糖與裝液量之間交互影響效應的響應面圖。由圖可見，在角鯊烯產量達到峰值前，葡萄糖濃度及裝液量的變化對角鯊烯產量影響非常明顯。隨著葡萄糖濃度的增加，角鯊烯產量不斷增加；裝液量增加，角鯊烯產量提高。但當葡萄糖濃度達到約67g·L-1后，增加葡萄糖濃度不能提高角鯊烯產量；與之相對，當裝液量在約40mL后，增加裝液量會使角鯊烯產量略微減少。因此，控制葡萄糖濃度在60～70g·L-1，裝液量在40～45mL之間時，角鯊烯產量最高。

表4　中心組合實驗設計及結果

注：各符號表示含義X1，葡萄糖含量(g·L-1)；X5，培養溫度(℃)；X6，初始接種量(%，V/V)；X8，裝液量(mL)。X1，Glucose concention(g·L-1); X5， Culture temperature(℃); X6， Inocultion quantity(%,v/v); X8， Loding(mL).

表5　角鯊烯二次多項模型的方差分析表

(A.葡萄糖與培養溫度對角鯊烯產量的影響；B.培養溫度與裝液量對角鯊烯產量的影響；C.葡萄糖與裝液量對角鯊烯產量的影響；D.葡萄糖與接種量對角鯊烯產量的影響。The effects on Squalene yield by different factorsa A.Glucose concentration and culture temperature; B.Temperature and loadings; C.Glucose concentration and loadings; D.Glucose concentation and inoculation quantity.)

圖22種因素的交互效應進行分析和評價

Fig.2The interaction effects of two factors

圖2D顯示葡萄糖與接種量之間響應曲面圖。由此圖可知，葡萄糖及接種量的變化對角鯊烯產量影響明顯。前期隨著葡萄糖濃度的升高，角鯊烯產量不斷增加，到達峰值67 g·L-1時，隨著葡萄糖濃度升高，角鯊烯產量略微減少；與之類似，前期隨著接種量的增加，角鯊烯產量不斷增加，到達1.5%時，隨著接種量的增加，角鯊烯產量逐漸減少。因此葡萄糖濃度在60～70 g·L-1，接種量比例在1.4%～1.6%之間時，角鯊烯產量最高。

綜上所述，低水平或高水平的影響因素都不利于角鯊烯產量的提高，當葡萄糖濃度在60～70 g·L-1，培養溫度在24～28℃，接種量比例在1.4%～1.6%之間，裝液量在40～45 mL/250 mL，角鯊烯產量最高。當濃度過高或過低時，都會導致角鯊烯產量下降。

從圖2中可直觀地看出各因子對響應值的影響變化趨勢，并且回歸模型存在最大值。在葡萄糖濃度為67.2 g·L-1、接種量為1.5%、培養溫度為26℃、裝液量在41 mL/250 mL的最優培養條件下角鯊烯產量理論最大值可達1.1508 g·L-1。為了檢驗模型預測的準確性，在優化的條件下進行發酵實驗，所得角鯊烯產量為1.1520 g·L-1，這與響應面模型預測結果十分接近，可見該模型能較好地預測實際發酵情況。

3討論

角鯊烯即三十碳六烯，屬于脂質不皂化物，具有眾多重要的生理活性。目前，角鯊烯多從鯊魚肝臟提取。日益嚴重的環境污染使其難以保證質量安全，同時，大量捕撈鯊魚也會造成資源枯竭，加劇生態破壞。利用微生物發酵生產角鯊烯，既可以避免質量不可控的風險，也能保護生態資源，因此，微生物生產角鯊烯越來越受到研究者的關注。微生物發酵生產角鯊烯不僅可以解決角鯊烯來源問題，產生巨大的經濟效益；同時推動角鯊烯的普及，產生良好的社會效應。與此同時，間接保護深海鯊魚，維護海洋生態平衡。目前，微生物發酵工藝日益成熟，角鯊烯生產菌株開發突飛猛進，微生物發酵生產角鯊烯前景廣闊。

本研究室前期從近海淤泥中分離篩選獲得了一株可以產角鯊烯的類酵母。本文就是在此基礎上，對該類酵母的培養條件進行優化，以期獲得發酵生產角鯊烯優化工藝。前期實驗表明，培養基成分中的葡萄糖濃度和酵母抽提物濃度；發酵培養中的初始pH、培養溫度、搖床轉速、裝液量、接種量、瓶型和培養時間都會對角鯊烯的產量產生影響。為了確定以上九個因素對角鯊烯發酵生產的影響開展了本研究。首先采用Plackett-Burman實驗，篩選出來影響角鯊烯生產的顯著因素。其中，酵母抽提物、初始pH值、瓶型、轉速、培養時間影響均不顯著。瓶型和轉速是通過溶氧影響角鯊烯合成途徑和生物量，在本研究條件下，可能是發酵過程對溶氧需求不高，造成以上兩個條件影響不顯著；初始pH值影響不顯著，說明菌株具有較為廣泛的pH適應性；酵母抽提物影響不顯著，而葡萄糖影響顯著，說明生物量能顯著影響角鯊烯產量，但碳氮比對角鯊烯產量影響有限；Pseudozymasp. SD301菌株在培養4～6天時一直處于穩定期，發酵體系的代謝水平處于穩定狀態，所以對角鯊烯的總生產量影響不顯著。

通過響應面法優化篩選得到的顯著因素。采用響應面法優化發酵條件可以將函數關系運用圖形技術顯示，憑借直覺觀察其最優點。當然響應面優化需要一定的前期工作基礎。結果顯示接種量-裝液量；接種量-葡萄糖；接種量-培養溫度交互效應影響角鯊烯產量均不明顯。這可能是因為接種量在跨度較大時，可較為明顯影響角鯊烯產量，所以在Plackett-Burman實驗中成為顯著因素；在中心組合中，接種量跨度減小，其對角鯊烯產量影響減小，不顯著。因而，可以得到結論：在發酵類酵母Pseudozymasp.SD301生產角鯊烯時，接種量大致控制在1.5%左右即可，不需要很嚴格控制，這也更加利于工業生產操作。

通過優化發現，葡萄糖、培養溫度、接種量、裝液量是影響角鯊烯發酵的顯著因素。優化后發酵條件為:葡萄糖濃度為67.2 g·L-1、接種量為1.5%、培養溫度為26℃、裝液量在41 mL/250 mL。利用優化得到的理論最優發酵條件，進行250 mL搖瓶發酵，角鯊烯的產量為1.152 g·L-1，與響應面模型預測值相吻合。這一結果比未優化時的產量提高362%。說明該菌株具有潛力成為生產角鯊烯的工業菌株，響應面法優化發酵條件卓有成效。本實驗為搖瓶水平實驗，相信通過上罐發酵優化，優化培養基組成，特別是控制溶氧等手段可進一步提高角鯊烯產量。本研究為工業化海洋微生物產角鯊烯提供了菌株和發酵工藝，也為下一步發酵優化提供了工作基礎。

致謝:感謝馮銀剛研究員在文章修改過程中給予的寶貴指導；感謝馬增新博士在實驗過程中給予的大力幫助。

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責任編輯徐環

技術報告

Optimization of Fermentation Conditions for Squalene Production by Marine Microbe Using Response Surface Methodology

WANG Xiao-Long1, TAN Yan-Zhen2,3, HOU Lu-Kuan1, CUI Qiu2,3,4, SONG Xiao-Jin2,3, LI Wen-Li1

(1. The Key Laboratory of Marine Drugs, Ministry of Education, School of Medicine and Pharmacy, Ocean University of China, Qingdao 266003, China；2.Qingdao Engineering Laboratory of Single Cell Oil, Qingdao 266101, China；3.Shandong Provincial Key Laboratory of Energy Genetics, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China；4.The Key Laboratory of Biofuels, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China)

Abstract:Fermentation conditions for squalene production by marine microbe Pseudozyma sp. SD301 were optimized in shake flask using response surface methodology (RSM). Based on the results obtained from the single factor tests, response surface analysis was designed with Design-Expert. The effects of glucose concentration, inoculation quantity, culture temperature and loading quantity on the yield of squalene were studied using RSM.By the central composite design,a predictive polynomial quadratic model was set up and the optimum fermentation conditions were developed.The theoretical optimal culture conditions are as follows: concentration of glucose was 67.2 g·L(-1)， inoculation quantity was 1.5% (v/v), culture temperature was 26 ℃, loading quantity was 41 mL in a 250 mL flask. Under these conditions, the yield of squalene reached 1.152g·L(-1), which is consistent with the predicted value of 1.1508 g·L(-1), representing a 3.62-fold increase compared to the original conditions.

Key words:squalene； fermentation optimization； plackett-burman； response surface methodology

DOI：10.16441/j.cnki.hdxb.20140443

中圖法分類號：Q936

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5174(2016)04-089-07

作者簡介：王曉龍(1989-)，男，碩士生。E-mail：wangxiaolong1022@126.com**通訊作者：E-mail：liwenli@ouc.edu.cn

收稿日期：2015-01-07；

修訂日期：2015-03-25

*基金項目：國家自然科學基金面上項目(31171201);國家自然科學基金青年基金項目(41306132)資助

Supported by the National Natural Science Foundation of China (31171201,41306132)